楊娟英 林玉紅 謝 偉 陜西步長制藥有限公司 (西安 710075)

隨著人們生活水平的提高,飲食營養(yǎng)的改善,嗜食肥甘厚味,醇酒瓊漿,營養(yǎng)過剩,體態(tài)肥胖,以及糖尿病、慢性肝炎等調(diào)治不當(dāng),或長期服用損肝藥物,導(dǎo)致脂肪代謝紊亂,脂肪肝患者日益增多。目前治療脂肪肝的上市藥物還是以西藥為主,但尚無理想的抗脂肪肝藥品,且西藥本身具有較大的副作用,降脂膠囊以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo),主要由龍膽、虎杖、茵陳、廣藿香和陳皮等藥材組成,具有清肝利膽、健脾化濕之功。對(duì)于脂肪肝出現(xiàn)的肝臟腫大、肝功異常、神疲體倦、脘腹痞滿、兩脅脹痛、食欲不振、惡心嘔吐、大便不調(diào)等癥,起到很好治療康復(fù)作用。

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)降脂膠囊制劑進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,為有效控制該制劑的質(zhì)量提供了重要的依據(jù)和方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀,Empower色譜工作站,2996二極管陣列檢測器;SB3200DT超聲波清洗機(jī);GB203電子天平。

1.2 試藥 龍膽苦苷對(duì)照品、龍膽對(duì)照藥材、百秋李醇對(duì)照品、茵陳對(duì)照藥材、虎杖對(duì)照藥材(中國藥品生物制品檢定所提供),甲醇、乙腈均為色譜純,其他試劑均為分析純。降脂膠囊由陜西步長制藥有限公司生產(chǎn)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層層析定性鑒別[1]

2.1.1 龍膽的薄層鑒別分別取供試樣品、龍膽對(duì)照藥材及陰性樣品內(nèi)容物各約 0.5g,加甲醇 5mL,浸泡 4-5h,濾過,濾液濃縮至 2mL,作為供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性樣品溶液;照薄層色譜法(中國藥典 2005年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn),吸取供試品溶液、陰性樣品溶液及對(duì)照藥材溶液各 1～ 2 μL分別點(diǎn)于同一硅膠 GF254薄層板上,以醋酸乙酯-甲醇-水 (20∶ 2∶1)為展開劑,展開 ,取出 ,晾干,置紫外燈(254nm)下檢視,供試品色譜中,在與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),而陰性無干擾。

2.1.2 虎杖的薄層鑒別分別取供試樣品與陰性樣品內(nèi)容物及虎杖對(duì)照藥材各約 0.5g,加甲醇 25ml,加熱回流 1h,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)?2.5mol/L硫酸溶液 10ml,超聲處理 5min,加氯仿 10mL,加熱回流1h,冷卻,分取氯仿層,酸液用氯仿提取 2次,每次8mL,合并氯仿液,濃縮至約 1mL作為供試品與陰性樣品溶液及對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄 VIB)試驗(yàn),吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性樣品溶液各 2 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶ 1)的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外燈(365nm)下檢視;供試品色譜中,在與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上,顯相同橙黃色的熒光斑點(diǎn),而陰性無干擾。

2.1.3 茵陳的薄層鑒別取供試樣品及陰性樣品內(nèi)容物各約 0.4g,加甲醇 20mL,浸泡過夜,超聲處理20min,濾過,濾液濃縮至約 2mL,作為供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液;另取茵陳對(duì)照藥材 0.2g,同法制備,即得茵陳對(duì)照藥材溶液;照薄層色譜法 (中國藥典2005年版一版附錄 VI B)試驗(yàn),吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液及茵陳對(duì)照藥材溶液各 5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上,以環(huán)己烷-甲苯-醋酸乙酯-甲酸 (5∶5∶10∶ 0.5)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外燈(365nm)下檢視;在供試品色譜中,在與對(duì)照藥材溶液主斑點(diǎn)相應(yīng)位置上,顯相同的紅色斑點(diǎn),而陰性溶液在相應(yīng)的位置上無此斑點(diǎn)。

2.1.4 廣藿香的薄層鑒別取供試樣品內(nèi)容物 0.5g,加的石油醚 (30～ 60℃ )10mL,冷浸 1h,過濾 ,殘?jiān)猛谐淌兔鸦亓魈崛?2次,每次 10m L,保持微沸1h,過濾,合并提取液,減壓濃縮至約 2mL,作為供試品溶液。另取百秋李醇對(duì)照品,加醋酸乙酯制成每1mL含 1mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典 2005年版一版附錄 VIB)試驗(yàn)。吸取供試品溶液 10 μ L,對(duì)照品溶液 5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上,以正己烷-醋酸乙酯(6:1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以 5%香草醛-硫酸溶液,加熱至斑點(diǎn)清晰,供試品色譜中,在與對(duì)照品溶液相應(yīng)的位置上,應(yīng)顯相同顏色的斑點(diǎn),而陰性無干擾。

2.2 龍膽苦苷的含量測定[2]

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八硅氧烷鍵合硅膠為填充劑;用甲醇-水為流動(dòng)相,梯度洗脫 ,0～ 6.5min:甲醇 -水 (30∶ 70);8.5～ 13min:甲醇-水 (50:50);15～ 25min: 甲醇-水 (30:70)。流速:1mL/min;檢測波長:270nm;理論塔板數(shù)按龍膽苦苷計(jì)應(yīng)不低于3000[1]。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷對(duì)照品適量,加甲醇制成每 1.0mL含 0.2mg的溶液,即得。

2.2.3 供試品溶液的制備取膠囊劑 10粒,傾出內(nèi)容物,混勻,精密稱取約 0.15g,置具塞錐形瓶中,精密加甲醇 10mL,密塞,稱定重量,超聲處理 20min,放冷,稱定重量,加甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,取濾液,用微孔濾膜過濾,即得。

2.2.4 空白試驗(yàn)陰性對(duì)照的制備:以處方中藥味比例和制備工藝制成不含白芍的空白樣品,再按供試品制備方法處理,制成陰性對(duì)照溶液。吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液 10 μL注入液相色譜儀,依法測定。結(jié)果對(duì)照品溶液與供試品溶液在相同的保留時(shí)間有相應(yīng)的峰,而陰性對(duì)照沒有。說明測定的專屬性好、無干擾。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取龍膽苦苷對(duì)照品溶液 (濃度 0.2mg/mL)2、 4、 6、 8、 10 μL,按上述色譜條件注入色譜儀,以峰面積 A為縱坐標(biāo),龍膽苦苷含量 C(μ g)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為A=1855224C+2954.8,相關(guān)系數(shù) r=0.9999,龍膽苦苷在 0.0865～ 0.433 mg/ml之間有良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn)取龍膽苦苷對(duì)照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣 6次,記錄峰面積,結(jié)果 RSD為 0.8%,表明本方法精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)取本品適量,共 6份,照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,分別精密取 10 μL進(jìn)樣,在上述色譜條件下測得樣品,RSD為 2.58%,表明此方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)采取加樣回收法,取一定量已知含量的樣品 6份,分別加入龍膽苦苷對(duì)照品適量,照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,在上述色譜條件下測定含量,計(jì)算回收率(數(shù)據(jù)見表 1)。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果表

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn):精密取本品適量,照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液 ,分別于 0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣 10 μL,記錄的峰面積,結(jié)果見表 2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

結(jié)果表明:該供試品在 24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 樣品的含量測定取本品 3批樣,照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,依上述色譜條件測定,測定結(jié)果分別為 5.12mg/粒,5.04 mg/粒,4.77 mg/粒?？紤]到生產(chǎn)實(shí)際情況,含量限度定為每粒含龍膽以龍膽苦苷 (C16H20O9)計(jì)不得少于 4.0mg/粒。

3 討 論 在本實(shí)驗(yàn)薄層色譜研究中,對(duì)于龍膽、虎杖、茵陳和廣藿香的薄層色譜條件,我們從展開劑的種類、比例及展開條件等均進(jìn)行了深入研究,最終制定出了簡便、可行的鑒別方法。

在龍膽苦苷的含量測定實(shí)驗(yàn)中,我們對(duì)其色譜條件和系統(tǒng)適用性進(jìn)行科學(xué)的考究,充分對(duì)比等度洗脫和梯度洗脫的色譜峰分離度,雜質(zhì)峰和溶劑峰的干擾性,最終優(yōu)選出了梯度洗脫的色譜條件,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該條件分離度好,無干擾峰,精密度高,可以作為該制劑的定量控制指標(biāo)。

我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)研究過程中,曾嘗試對(duì)該制劑中陳皮等藥材進(jìn)行薄層鑒別,經(jīng)過反復(fù)摸索展開比例和條件,最終色譜結(jié)果還是不太清晰和穩(wěn)定,故尚未選入此質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典.一部[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:1.

[2] 王冬梅.安宮消瘤膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究 [J].中藥材,2008,31(12):1911.