張彥妮，邊紅琳，陳立新

(1.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江省農(nóng)科院園藝分院，黑龍江 哈爾濱 150069)

蝴蝶蘭(Phalaenopsisamabilis)，又名蝶蘭，為蘭科蝴蝶蘭屬植物，其姿態(tài)優(yōu)美、色澤豐富、艷麗，花期持久。在熱帶蘭中素有“蘭花皇后”之美稱，是蘭科植物中栽培最廣泛的四大觀賞熱帶蘭之一，是室內(nèi)綠化美化重要的觀賞花卉，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)其需求量大。但是，由于蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，很難用傳統(tǒng)分株方式進(jìn)行無(wú)性繁殖；且蝴蝶蘭種子極小，沒(méi)有胚乳，發(fā)育不完全，極難萌發(fā)。組織培養(yǎng)作為生物技術(shù)育種的基礎(chǔ)，可以解決繁殖慢、種苗供不應(yīng)求的難題[1-2]。目前，隨著生物工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，組織培養(yǎng)也已成為蘭花快速繁殖的重要手段。關(guān)于蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)有許多報(bào)道[3-6]，這些研究多是以蝴蝶蘭的葉片[7]、莖尖[7-8]、花梗腋芽[7-10]、種子[11]、根尖[7]、花梗節(jié)間[12]為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，對(duì)以花梗為外植體的研究，大多是以未開(kāi)花或即將開(kāi)花的花梗為外植體，這對(duì)母株傷害較大，影響其觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究以較為幼嫩的廢棄的蝴蝶蘭花梗(為使花期一致，通常剪掉提前抽出的花梗)為外植體，在培養(yǎng)基上誘導(dǎo)休眠芽的萌發(fā)，通過(guò)萌發(fā)的幼苗的莖尖為材料進(jìn)行類原球莖的誘導(dǎo)、增殖、分化、生根，初步建立組織培養(yǎng)再生體系，為蝴蝶蘭的大量繁殖探索新的有效的材料和途徑。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 供試的蝴蝶蘭幼嫩的花梗由黑龍江省農(nóng)科院園藝分院觀賞溫室提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1花梗的消毒 取具有休眠芽的蝴蝶蘭幼嫩花梗，將其橫切成1.5～2.0 cm(每段帶1個(gè)花芽)，用75%的酒精棉球擦去表面灰塵。然后在洗衣粉中浸泡10～15 min，期間不斷搖晃，再用自來(lái)水沖洗20～30 min；在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精浸泡10～30 s；在0.1%升汞溶液中浸泡5～20 min；無(wú)菌水沖洗3～7次，用無(wú)菌濾紙吸干花梗表面的水分，將花梗剪成長(zhǎng)1.0～1.5 cm的小段(每段帶1個(gè)花芽)，接種到不同培養(yǎng)基上；先暗培養(yǎng)14～21 d，然后再將其放入光照條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為(25±2)℃，光/暗周期為14 h/10 h，光照強(qiáng)度2 500～3 500 lx。

1.2.2誘導(dǎo)分化及增殖培養(yǎng) 將消毒后的花?；驘o(wú)菌苗的莖尖，在無(wú)菌條件下，將其切割成適當(dāng)大小后，接種于不同的誘導(dǎo)分化和增殖培養(yǎng)基上，比較其萌發(fā)、生長(zhǎng)、分化和增殖狀況。

1.2.3組培苗的生根誘導(dǎo) 當(dāng)獲得的組培苗長(zhǎng)到2～3 cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L上進(jìn)行生根誘導(dǎo)，一個(gè)月后統(tǒng)計(jì)生根率、根的長(zhǎng)度以及生根狀況等。

所有培養(yǎng)基均附加10%椰子汁、0.1%活性炭、20 g/L白砂糖和8 g/L瓊脂，然后用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值為5.4～5.6。在121℃條件下高壓滅菌13 min。

1.2.4組培苗的馴化和移栽 參照張彥妮等[13]的方法進(jìn)行組培苗的馴化和移栽。

1.3統(tǒng)計(jì)分析 為判定各種激素組合對(duì)蝴蝶蘭花梗腋芽萌發(fā)率、分化率、死亡率及腋芽組培苗莖尖分化率的影響，采用前向逐步回歸分析判斷各激素貢獻(xiàn)率及其顯著性、顯著因子，再用單因素方差分析各激素濃度對(duì)萌發(fā)率、分化率及死亡率的影響，采用單因素顯著性檢驗(yàn)方差分析的顯著性。多元回歸分析和方差分析用Statistica 6.0完成(StatSoft, Inc.)。

2 結(jié)果與分析

2.1蝴蝶蘭花梗消毒方法和消毒時(shí)間的比較 滅菌時(shí)間對(duì)外植體的消毒效果和成活率至關(guān)重要。用0.1%升汞消毒不同時(shí)間，花梗腋芽培養(yǎng)2～7 d后，接種的一部分腋芽表面污染，一部分生長(zhǎng)良好。滅菌時(shí)間短，污染率高，但長(zhǎng)時(shí)間的消毒，對(duì)外植體的傷害較重，接種后外植體萌發(fā)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。滅菌時(shí)間在15 min時(shí)，污染率較低，萌發(fā)時(shí)間相對(duì)較早，滅菌時(shí)間在20 min時(shí)，污染率雖然最低，但萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)(表1)。

表1 0.1%升汞不同消毒時(shí)間的處理效果

2.26-BA與NAA組合對(duì)蝴蝶蘭花梗腋芽萌發(fā)和分化的影響 在不同培養(yǎng)基上的蝴蝶蘭花梗腋芽萌發(fā)及生長(zhǎng)結(jié)果表明(表2、表3)，花梗腋芽在接種3 d后，就出現(xiàn)萌動(dòng)膨大現(xiàn)象(圖1A和圖1B)，有的花梗腋芽在35 d左右就長(zhǎng)出小葉；有的在腋芽周圍突起，以后逐漸發(fā)育成幾個(gè)不定芽(圖1C)。這些不定芽芽大小不等，表明不定芽的分化不同步或生長(zhǎng)發(fā)育不一致。

激素種類和濃度對(duì)于花梗腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)有一定的影響。在培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L上，蝴蝶蘭花梗腋芽的萌發(fā)率最高，達(dá)40%。在培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.5mg/L上，花梗腋芽產(chǎn)生的不定芽數(shù)量最多，分化率最高，但整體長(zhǎng)勢(shì)一般?？赡苁怯捎?-BA促進(jìn)不定芽的形成，但影響了植株的長(zhǎng)勢(shì)?；üＲ秆拷臃N后，在每種培養(yǎng)基上均有較高的死亡率，均是因?yàn)楹只斐傻?。這可能與蝴蝶蘭中含有較多的酚類物質(zhì)有關(guān)。

表2 在不同1/2 MS培養(yǎng)基上蝴蝶蘭花梗腋芽的萌發(fā)生長(zhǎng)狀況

表3 在不同MS培養(yǎng)基上蝴蝶蘭花梗腋芽的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)狀況

圖1 接種的花梗腋芽膨大萌發(fā)及產(chǎn)生的不定芽

多元回歸分析表明，NAA、2,4-D和6-BA對(duì)蝴蝶蘭花梗腋芽萌發(fā)率的影響基本相當(dāng)，都沒(méi)有達(dá)到95%的顯著水平(結(jié)果未列出)。NAA、2,4-D和6-BA對(duì)蝴蝶蘭花梗腋芽死亡率的影響中，NAA和2,4-D都顯著影響死亡率，但NAA影響更強(qiáng)，6-BA不顯著。分別對(duì)NAA和2,4-D與死亡率做單因素方差分析，結(jié)果表明(圖2)，NAA質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時(shí)蝴蝶蘭死亡率最高，濃度為0時(shí)死亡率最低。2,4-D兩個(gè)質(zhì)量濃度的方差分析結(jié)果不顯著。NAA、2,4-D和6-BA對(duì)蝴蝶蘭花梗腋芽分化率的影響中，6-BA的影響更為主要(達(dá)到95%顯著水平)，單因素方差分析發(fā)現(xiàn),隨6-BA濃度增加(圖3)，蝴蝶蘭花梗腋芽分化率增加。

在附加不同濃度激素的MS培養(yǎng)基上，花梗腋芽萌發(fā)率較高(表3)。在培養(yǎng)基MS+6-BA 2 mg/L+2,4-D 0.01 mg/L上，萌發(fā)率為54.5%，分化率為18.2%，產(chǎn)生的芽數(shù)較多(圖1D)。

2.3激素組合對(duì)蝴蝶蘭花梗腋芽組培苗莖尖誘導(dǎo)的影響 將花梗腋芽組培苗的葉子剝?nèi)?，?.5～2.5 mm莖尖，將其接種在附加不同激素種類和濃度的培養(yǎng)基上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有些莖尖顏色變綠，30 d后上面出現(xiàn)顆粒狀的亮綠色的組織，這些組織逐漸長(zhǎng)成類原球莖(圖4)，2～3個(gè)月后，這些類原球莖有的長(zhǎng)出小葉，有的繼續(xù)分化類原球莖(圖5)。不同的培養(yǎng)基對(duì)花梗腋芽組培苗莖尖的誘導(dǎo)效果不同(表4)。在培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 6 mg/L+NAA 0.2 mg/L和1/2 MS+6-BA 5 mg/L+2,4-D 0.01 mg/L上，莖尖的分化率最高，為50%。在前一種培養(yǎng)基上有16.7%誘導(dǎo)出類原球莖，33.3%誘導(dǎo)出不定芽。后一種培養(yǎng)基上只誘導(dǎo)出類原球莖。在其他培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率相對(duì)較低，多數(shù)外植體因褐化而死亡。

圖2 在1/2 MS培養(yǎng)基上NAA和2,4-D濃度梯度蝴蝶蘭花梗腋芽死亡率方差分析結(jié)果

圖3 在1/2 MS培養(yǎng)基上6-BA濃度梯度蝴蝶蘭花梗腋芽分化率方差分析結(jié)果

圖4 膨大的莖尖及莖尖產(chǎn)生的類原球莖

多元回歸分析表明，TDZ、NAA、2,4-D和6-BA對(duì)蝴蝶蘭花梗腋芽組培苗莖尖分化率的影響中，6-BA和NAA對(duì)莖尖分化率影響較大(達(dá)到95%顯著水平)，但6-BA影響更強(qiáng)，TDZ和2,4-D未達(dá)到顯著程度(多元回歸分析結(jié)果未列出)。分別對(duì)6-BA和NAA與莖尖分化率做單因素方差分析，結(jié)果表明，隨6-BA濃度增加，蝴蝶蘭莖尖分化率增加。NAA的方差分析結(jié)果并不顯著(圖6)。

圖5 增殖的類原球莖

2.4原球莖增殖培養(yǎng) 將類原球莖切成0.5 cm2大小的塊，接種在附加不同濃度的NAA和6-BA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后，再進(jìn)行切割轉(zhuǎn)移，通過(guò)這種方式使原球莖成倍增長(zhǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表5)，在培養(yǎng)基MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.2 mg/L上，類原球莖增殖倍數(shù)最高，為4.7，產(chǎn)生的類原球莖顏色為綠色，顆粒狀，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，有的類原球莖變?yōu)槿辄S色(圖6)。因此，該培養(yǎng)基為蝴蝶蘭類原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基MS+6-BA 10 mg/L+NAA 0.5 mg/L上，原球莖在增殖的同時(shí), 有的產(chǎn)生大量叢生芽, 但叢生芽長(zhǎng)得較為弱小?？赡苁?-BA濃度過(guò)高導(dǎo)致的。因?yàn)榧?xì)胞分裂素是一類較活躍的植物激素，它不僅能促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂和增大，而且在芽分化的誘導(dǎo)、葉綠體的發(fā)育、養(yǎng)分的運(yùn)輸和分配、細(xì)胞衰老的抑制等方面都表現(xiàn)顯著的效果。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在增殖時(shí)一定要對(duì)類原球莖先切割后培養(yǎng)，這樣效果比不切割的要增殖的數(shù)量多。原球莖分化比較容易，原球莖在增殖后較長(zhǎng)時(shí)間不進(jìn)行轉(zhuǎn)移就能出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

2.5組培苗生根誘導(dǎo)和馴化移栽 組培苗生根的誘導(dǎo)也是植物組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵步驟。當(dāng)再生苗長(zhǎng)到1.2～2.0 cm時(shí)，繼代到附加0.5 mg/L NAA濃度的1/2 MS培養(yǎng)基中中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，50 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。結(jié)果表明(圖7)，98%的無(wú)菌苗均生根。并且生長(zhǎng)良好。經(jīng)過(guò)馴化的組培苗移栽后生長(zhǎng)良好，成活率為89.3%。

表4 在不同1/2 MS培養(yǎng)基上蝴蝶蘭花梗腋芽組培苗莖尖的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)狀況

圖6 在1/2 MS培養(yǎng)基上不同6-BA和NAA濃度蝴蝶蘭花梗腋芽組培苗莖尖分化率方差分析結(jié)果

表5 在MS培養(yǎng)基上的繼代增殖培養(yǎng)

圖7 生根和馴化的無(wú)菌苗

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，對(duì)蝴蝶蘭組織培養(yǎng)報(bào)道較多的是以僅開(kāi)一兩朵花且下面花芽飽滿的花梗、幼葉、莖尖和根尖等多種器官為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究[10]，但這些方法對(duì)母株都有不同程度的損傷。本研究選用的是幼嫩的花梗(為控制花期一致剪掉的花梗)作為外植體，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，初步建立了組織培養(yǎng)再生體系。雖然誘導(dǎo)率相對(duì)較低，但這樣既不損傷母株，又可節(jié)約成本，充分利用材料，繁殖大量?jī)?yōu)良品種，比采用蝴蝶蘭根尖、莖尖進(jìn)行快速無(wú)性繁殖更有應(yīng)用價(jià)值，特別是對(duì)一些稀有品種的保存和快繁[14]。

在植物組織培養(yǎng)中，外源生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是細(xì)胞離體培養(yǎng)所必需的激素，合適的濃度及兩者之間的適宜配比不但可以誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，而且能控制細(xì)胞分化和形態(tài)建成[15]。王麗艷等[16]認(rèn)為，激素是誘導(dǎo)組培苗增殖的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)培養(yǎng)的成敗起著決定性的作用。本研究結(jié)果證明激素種類和濃度對(duì)于花梗腋芽啟動(dòng)培養(yǎng)有一定的影響。6-BA和 NAA的共同作用可以促進(jìn)蝴蝶蘭花梗腋芽萌發(fā)，在培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 2 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L上，蝴蝶蘭花梗腋芽的萌發(fā)率最高。不同的培養(yǎng)基對(duì)蝴蝶蘭莖尖的誘導(dǎo)效果不同，較高濃度的6-BA有助于莖尖原球莖的誘導(dǎo)和增殖，濃度低誘導(dǎo)效果相對(duì)較差[17]。在培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 6 mg/L+NAA 0.2 mg/L和1/2 MS+6-BA 5 mg/L+2,4-D 0.01 mg/L上，莖尖的分化率最高。在前一種培養(yǎng)基上有16.7%誘導(dǎo)出類原球莖，33.3%誘導(dǎo)出不定芽。后一種培養(yǎng)基上只誘導(dǎo)出類原球莖。在其他培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率相對(duì)較低，多數(shù)外植體因褐化而死亡。在原球莖增殖培養(yǎng)過(guò)程中，在培養(yǎng)基MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.2 mg/L上，類原球莖增殖倍數(shù)最高，為4.7，產(chǎn)生的類原球莖顏色為綠色，顆粒狀。因此該培養(yǎng)基為蝴蝶蘭類原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基。

金忠民等[18]認(rèn)為提高愈傷組織誘導(dǎo)率是建立再生體系的第一步，沒(méi)有高頻的誘導(dǎo)率，便無(wú)法得到大量的、高品質(zhì)的愈傷組織，其隨后的分化及生根也難以進(jìn)行。對(duì)于蘭科植物來(lái)說(shuō)，提高原球莖的誘導(dǎo)率則是建立再生體系的關(guān)鍵技術(shù)，本試驗(yàn)原球莖的誘導(dǎo)率相對(duì)較低，有待于進(jìn)一步深入研究提高類原球莖的誘導(dǎo)率。此外，越來(lái)越多的研究表明，蘭花類原球莖形成過(guò)程是典型的體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育過(guò)程，且是單細(xì)胞起源的[19-20]。這為蘭科植物利用組織培養(yǎng)育種提供了理論基礎(chǔ)。組織培養(yǎng)也可以與化學(xué)誘變相結(jié)合的方法進(jìn)行多倍體或抗性育種[21-23]。在蘭科植物種質(zhì)資源創(chuàng)新方面具有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值。本研究為蝴蝶蘭的高頻再生組織培養(yǎng)體系建立、基因轉(zhuǎn)化、多倍體誘導(dǎo)或抗性育種奠定基礎(chǔ)。

[1] 劉進(jìn)平,吳發(fā)紅,王丹,等.柱花草愈傷組織培養(yǎng)與植株再生[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2007,16(3):136-138.

[2] 李文送.我國(guó)香根草繁殖方法的研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué),2007,24(7):33-36.

[3] 王平,吳海紅,趙興華,等.蝴蝶蘭組織培養(yǎng)培養(yǎng)基組成的初步研究[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,35(1):10-12.

[4] Liu T H,Lin J J,Wu R Y.The effects of using trehalose as a carbon source on the proliferation ofPhalaenopsisandDoritaenopsisprotocormrlike-bodies[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2006,86:125-129.

[5] 李軍,柴向華,曾寶珰,等.蝴蝶蘭組培工廠化生產(chǎn)技術(shù)[J].園藝學(xué)報(bào),2004,31(3):413-414.

[6] Murdad R,Hwa K S,Seng C K,etal.High frequency multiplication ofPhalaenopsisgiganteausing trimmed bases protocorms technique[J].Scientia Horticulturae,2006,111:73-79.

[7] 李娜.蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,20(9):51-53.

[8] 張偉,曾伏虎,張?zhí)K鋒.蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].信陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào),2004,17(3):335-337.

[9] 顧東亞,蔣素華,崔波,等.蝴蝶蘭組培快繁技術(shù)研究[J].北方園藝,2009,10:196-198.

[10] 劉亮,易自力,蔣建雄,等.蝴蝶蘭叢生芽、原球莖途徑的組織培養(yǎng)研究[J].亞熱帶植物科學(xué),2008,37(3):43-45.

[11] Chen J T,Chang W C.Induction of repetitive embryogenesis from seed-derived protocorms ofPhalaenopsisamabilisvar.formosashimadzu[J].In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant,2004,40(3):290-293.

[12] 魯雪華,徐立暉,郭文杰,等.蝴蝶蘭花梗節(jié)間段培養(yǎng)繁殖的初步研究[J].園藝學(xué)報(bào),2002,29(5):491-492.

[13] 張彥妮,陳立新,付艷麗.夏枯草(Prunellavulgaris)組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].分子植物育種,2007,5(3):383-388.

[14] 李子紅,賈燕.珍品蘭花快速繁殖與養(yǎng)護(hù)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2006.

[15] 葛軍,劉振虎,盧欣石.紫花苜蓿再生體系研究進(jìn)展[J].中國(guó)草地,2004,26(2):63-67.

[16] 王麗艷,荊瑞勇,肖莉杰,等.扁莖黃芪離體快繁及多倍體誘導(dǎo)[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2009,18(1):94-99.

[17] 葉曉青,謝東,魏書(shū),等.不同激素水平對(duì)蝴蝶蘭原球莖體增殖的影響[J].江蘇林業(yè)科技,2000,27(9):42-44.

[18] 金忠民,沙偉,張艷馥,等.羊茅種子愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系的建立[J].草業(yè)科學(xué),2010,27(10):60-63.

[19] Chen J T,Chang W C.Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf explants ofPhalaenopsisamabilis[J].Biologia Plantarum,2006,50(2):169-173.

[20] Kuo H L,Chen J T,Chang W C.Efficient plant regeneration through direct somatic embryogenesis from leaf explants ofPhalaenopsis‘little staeve’[J].In Vitro Cellular & Development Biology-Plant,2005,41(4):453-456.

[21] 崔廣榮,張子學(xué),張從宇,等.文心蘭多倍體誘導(dǎo)及其鑒定[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(1):184-190.

[22] 馬文芳,黃惠英,王清.外源激素對(duì)甘草愈傷組織誘導(dǎo)及染色體加倍的影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2008,17(3):142-145.

[23] 王小華,莊南生,王英,等.DES誘變與離體培養(yǎng)結(jié)合篩選柱花草抗寒突變體的研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19(1):263-267.