朱瑞芬,唐鳳蘭，劉杰淋，韓微波，劉鳳歧，陳積山

(黑龍江省農(nóng)科院草業(yè)研究所，黑龍江 哈爾濱 150086)

氮素固定是維系生產(chǎn)力的重要生態(tài)反應(yīng)[1]。目前全球范圍內(nèi)每年輸入生態(tài)系統(tǒng)的總氮量約為2億t，其中75%來自生物固氮[2]。紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上分布最廣的豆科牧草，其與根瘤菌形成的共生固氮體系是自然界固氮效率較高的一種生物固氮體系，在生產(chǎn)中已被廣泛應(yīng)用。但是豆科植物-根瘤菌共生固氮體系是高等植物與低等原核生物之間形成的一種非常復(fù)雜的共生固氮微生態(tài)系統(tǒng)，根瘤菌的存活以及根瘤的形成對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境十分敏感。大量使用除草劑不僅影響植物生長、根系發(fā)育及豆科植物-根瘤菌共生關(guān)系的形成及其活性，也使根瘤菌處于一個(gè)較低的群體水平，影響氮素的積累[3]。

咪唑乙煙酸屬咪唑啉酮類除草劑，屬于中長效除草劑,在土壤中殘效期長(1～3 a)，殘留量大。其作用機(jī)理為咪草煙屬咪唑啉酮類內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，土壤處理后通過植物根吸收,作用于分生組織，抑制其乙酰乳酸酶的生物合成導(dǎo)致生長受到抑制而死亡[4]。盡管豆科植物乙酰羥基酸合成酶活性較高[5]，能夠代謝和降解咪唑啉酮類除草劑，但敏感植物由于代謝速度慢仍受危害[6]。事實(shí)上，在除草劑使用歷史最久、用量與使用面積最大的黑龍江省，幾乎年年都發(fā)生藥害，只是程度與面積之間有一定差異，其中氯嘧磺隆 (豆磺隆)與咪唑乙煙酸是造成作物藥害的主要除草劑品種[7]。據(jù)報(bào)道，咪唑乙煙酸(5%水劑)在黑龍江省單劑年銷量約3 500 t，使用面積為(1.33×106)～(2×106) hm2[8]，是普遍使用的一類咪唑啉酮類除草劑。隨著苜蓿產(chǎn)業(yè)化的不斷擴(kuò)大，除草劑咪唑乙煙酸在我國苜蓿主要栽培區(qū)域使用廣泛，已經(jīng)對(duì)寄主植物、土壤微生物及土壤微生物和寄主植物之間的關(guān)系造成一些負(fù)面影響[9]，尤其是對(duì)作物的生長將產(chǎn)生一定的影響[10]。

因此，為充分發(fā)揮苜蓿的固氮作用，達(dá)到高產(chǎn)目的同時(shí)又保持土壤的無污染原則，本研究利用咪唑乙煙酸除草劑的土壤處理來研究其對(duì)紫花苜蓿及其根瘤菌共生固氮的影響，以期為黑龍江地區(qū)苜蓿高產(chǎn)栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試苜蓿品種 耐寒、耐旱、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)農(nóng)牧801紫花苜蓿(M.sativaNongmu 801)。

1.2供試藥劑 5.0%咪唑乙煙酸水劑(imazethapy，通用名咪草煙，商品名稱普施特, 遼寧省丹東市農(nóng)藥總廠生產(chǎn))。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法 本試驗(yàn)于2009年在國家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系綏化綜合試驗(yàn)站(125°28′24″ E，46°32′17″ N)進(jìn)行。試驗(yàn)站年降水量469.7 mm，年均氣溫2.9 ℃，≥10 ℃年積溫2 760 ℃·d，年均日照時(shí)數(shù)2 713 h，無霜期130 d，屬大陸性季風(fēng)氣候。試驗(yàn)地為前茬玉米(Zeamays)低產(chǎn)農(nóng)田，土壤類型以黑鈣土和草甸土為主，土壤全鹽量0.157%，有機(jī)質(zhì)8.85 g/kg，全氮0.335 g/kg，速效氮103.50 mg/kg，田間持水量平均22.71%， pH值8.12。2009年5月6日采用改裝小麥播種機(jī)在旋耕后的前茬玉米低產(chǎn)田進(jìn)行條播農(nóng)牧801紫花苜蓿品種，播種量15 kg/hm2，播種面積667 m2，播種后鎮(zhèn)壓處理，再進(jìn)行小區(qū)劃方并打樁標(biāo)界，共15個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積40 m2，區(qū)間道1.5 m，3次重復(fù)。整個(gè)試驗(yàn)期間不灌水不施肥，適時(shí)人工除雜，管理等同大田。

試驗(yàn)根據(jù)5%咪唑乙煙酸水劑的有效劑量共設(shè)4個(gè)處理(0.067 5、0.082 5、0.097 5和0.112 5 kg/hm2)，空白對(duì)照以清水噴霧處理。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組排列方式，在劃定的小區(qū)進(jìn)行咪唑乙煙酸苗前(在播種后第2天施藥)土壤處理。噴施咪唑乙煙酸時(shí)，為嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)誤差，選擇型號(hào)和性能一致的施藥器械，不同處理使用的施藥器械不能混用。施藥器械為背負(fù)式噴霧器(knapsack hydraulic sprayer)，四噴頭，噴嘴型號(hào)為 TEEJET80015VS，噴施壓力為0.25～0.3 MPa，噴液量為 150 L/hm2。每處理兌水500 kg/hm2。噴藥時(shí)風(fēng)力1～2級(jí)，陣風(fēng)3級(jí)，施藥期間土壤墑情良好,無淹水、低溫、高溫、干旱等現(xiàn)象，噴藥后24 h無降水。噴藥任務(wù)由同一個(gè)人進(jìn)行，施藥時(shí)用擋板將相鄰小區(qū)隔開，以免飄移造成誤差。田間調(diào)查主要雜草有：稗草(Echinochloacrusgalli)、馬唐(Digitariasanguinalis)、藜(Chenopodiumalbum)、蒺藜(Tribulusterrestris)、反枝莧(Amaranthusretroflexus)。

1.4測(cè)定指標(biāo)與方法 噴藥后5、6、7、8、9和10 d對(duì)紫花苜蓿目測(cè)進(jìn)行出苗率及幼苗狀況調(diào)查。每天09：00―10：00調(diào)查紫花苜蓿的出苗數(shù)，與對(duì)照比較，計(jì)算相對(duì)出苗率(relative emerging rate,RER，%)；觀察紫花苜蓿的長勢(shì)、顏色進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)(synthetic evaluation values，SEV)，給出植株抑制程度評(píng)價(jià)得分。評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)為1～5分，1為長勢(shì)好、葉色濃綠；2分為葉色黃、但仍能繼續(xù)正常生長；3分為葉片萎縮、葉色黃、生長畸形；4分為植株嚴(yán)重抑制、不能恢復(fù)生長；5分為完全死亡[11], 在施藥后第10天不再出苗時(shí)結(jié)束苗數(shù)的統(tǒng)計(jì)。

噴藥后6、8和10 周取樣調(diào)查根瘤及生長狀況。在小區(qū)中間隨機(jī)挖取具有完整根系的紫花苜蓿 10 株，挖土深度為30 cm，用水仔細(xì)沖洗后統(tǒng)計(jì)根瘤數(shù)，以5分制計(jì)分法[11]對(duì)根瘤評(píng)分。評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)1～5分，1分為根瘤中空無內(nèi)容物的死亡根瘤；2分為根瘤切面灰白色的無效根瘤；3分為根瘤切面略呈粉紅色、直徑小于<0.5 mm；4分為根瘤切面呈粉紅色、1 mm>直徑≥0.5 mm；5分為根瘤切面呈粉紅色、直徑≥1 mm。

施藥后10 周選擇在紫花苜蓿生長均勻一致的1 m2樣方進(jìn)行測(cè)產(chǎn)，將地上部分在烘箱中120 ℃殺青40 min后在60 ℃烘干48 h，稱干質(zhì)量(dry weight, DW)。計(jì)算干質(zhì)量抑制率(dry weight inhibitory rate)。計(jì)算公式如下：

將烘干的草樣粉碎、稱量，采用凱氏定氮法測(cè)定植株全氮量[12]。

1.5數(shù)據(jù)分析 采用DPS 3.0專業(yè)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1不同劑量咪唑乙煙酸對(duì)紫花苜蓿出苗情況的影響 供試5.0%咪唑乙煙酸水劑的4個(gè)劑量(0.067 5、0.082 5、0.097 5和0.112 5 kg/hm2)在紫花苜蓿播后苗前施用，對(duì)紫花苜蓿出苗率和幼苗生長都有一定的影響，其程度隨藥劑劑量的不同而變化(表1)。施用劑量在0.067 5 kg/hm2對(duì)出苗和幼苗生長無明顯的抑制作用，平均相對(duì)出苗率在95.0%,幼苗長勢(shì)評(píng)價(jià)均數(shù)為1.48，與清水對(duì)照在同一水平差異不顯著(P≥0.05)。當(dāng)劑量提高至0.082 5、0.097 5和0.112 5 kg/hm2時(shí)，紫花苜蓿的出苗和生長都明顯受到抑制，相對(duì)出苗率分別降低至88.9%、80.1%和70.9%,幼苗長勢(shì)抑制程度評(píng)價(jià)顯著升高(P≤0.05)，依次達(dá)到2.24、2.37和2.59。隨著劑量升高，高于劑量0.067 5 kg/hm2的處理對(duì)紫花苜蓿出苗和幼苗生長的影響程度加重，幼苗生長畸形且枯萎。因此，5.0%咪唑乙煙酸水劑0.067 5 kg/hm2劑量是紫花苜蓿播后苗前土壤處理的臨界點(diǎn)，對(duì)其出苗和生長安全無害。

表1 不同劑量咪唑乙煙酸播后苗前處理對(duì)紫花苜蓿生長的影響

2.2不同劑量咪唑乙煙酸對(duì)紫花苜蓿根瘤的影響 分析根瘤數(shù)量、質(zhì)量及等級(jí)隨劑量增加的變化趨勢(shì)可知(表2)，5.0%咪唑乙煙酸水劑土壤處理后，在每個(gè)試驗(yàn)測(cè)定時(shí)期，隨著施用劑量的增加，紫花苜蓿根瘤數(shù)、根瘤干質(zhì)量、根瘤等級(jí)明顯降低，差異顯著。在6周測(cè)得紫花苜蓿根瘤數(shù)、干質(zhì)量和根瘤等級(jí)在0.05水平上，對(duì)照顯著高于劑量0.082 5、0.097 5和0.112 5 kg/hm2，與劑量0.067 5 kg/hm2差異不顯著,劑量0.082 5、0.097 5和0.112 5 kg/hm2三者之間在根瘤數(shù)和根瘤等級(jí)上依次顯著降低；在8 周測(cè)得紫花苜蓿根瘤數(shù)、干質(zhì)量和根瘤等級(jí)在0.05水平上，對(duì)照與劑量0.067 5和0.082 5 kg/hm2差異不顯著,但三者顯著高于劑量0.097 5和0.112 5 kg/hm2，而后二者之間依次顯著降低；在10周測(cè)得紫花苜蓿的根瘤數(shù)、干質(zhì)量和根瘤等級(jí)在0.05水平上，對(duì)照與劑量0.067 5、0.082 5和0.097 5 kg/hm2差異不顯著，但均顯著高于劑量0.112 5 kg/hm2。以上結(jié)果表明，咪唑乙煙酸土壤處理后，不同劑量對(duì)苜蓿根瘤數(shù)目、干質(zhì)量、根瘤等級(jí)的積累增長抑制時(shí)間不同，高劑量條件下具有較長時(shí)間的抑制作用，甚至導(dǎo)致植株生長受阻至萎蔫。中間劑量條件下隨著時(shí)間的推移可以解除對(duì)根瘤干物質(zhì)積累的抑制作用；低劑量經(jīng)過較短時(shí)間后，苜蓿根瘤生長狀況完全可以得到恢復(fù)或改善。雖然施藥后天氣出現(xiàn)持續(xù)干旱，加劇藥效的作用，延長了抑制作用時(shí)間，但劑量0.067 5 kg/hm2的田間表現(xiàn)的安全性仍為可靠。

表2 不同劑量咪唑乙煙酸對(duì)紫花苜蓿根瘤的影響

2.3不同劑量咪唑乙煙酸對(duì)紫花苜蓿植株的影響 供試5.0%咪唑乙煙酸水劑的4個(gè)劑量在紫花苜蓿播后苗前施用，與對(duì)照比，隨著5.0%咪唑乙煙酸水劑施用劑量的增加，植株干質(zhì)量均顯著降低(P≤0.05)。與對(duì)照干質(zhì)量(56.3 mg/株)相比，劑量0.082 5、0.097 5和0.112 5 kg/hm2使紫花苜蓿植株干質(zhì)量的積累量顯著降低(表3)。施藥10周后，劑量0.067 5 kg/hm2對(duì)紫花苜蓿植株干質(zhì)量沒有影響，無顯著抑制作用。劑量0.112 5 kg/hm2對(duì)紫花苜蓿干質(zhì)量影響最為嚴(yán)重，其原因可能是咪唑乙煙酸兼有土壤活性[13]，施藥10周后，藥劑完全被根系吸收,同時(shí)劑量0.112 5 kg/hm2已遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于咪唑乙煙酸的推薦用量，導(dǎo)致該劑量下土壤處理使紫花苜蓿植株生長嚴(yán)重受阻。

表3 不同劑量咪唑乙煙酸對(duì)紫花苜蓿植株干質(zhì)量的影響(藥后10周)

根瘤菌與寄主根系組成的共生固氮體可為苜蓿形成最佳產(chǎn)量和蛋白質(zhì)提供充足的氮源。5.0%咪唑乙煙酸水劑的4個(gè)劑量在紫花苜蓿播后苗前施用10周后，植株全氮量(mg/g)隨劑量遞增而呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，但差異不顯著(圖 1)。

圖1 不同劑量咪唑乙煙酸對(duì)紫花苜蓿植株全氮的影響

3 討論

豆科植物-根瘤菌共生體系是高等植物與低等原核生物之間形成的一種互惠互利共生固氮微生態(tài)系統(tǒng)，根瘤菌的存活以及根瘤的形成對(duì)土壤微生態(tài)環(huán)境十分敏感。Rick和Moorman[14]研究指出，咪唑乙煙酸作為理想的苜蓿地常用除草劑，可在苗前或苗后施用，苗前推薦用量為0.052～0.102 kg/hm2。王慶海等[15]認(rèn)為0.060 kg/hm2劑量對(duì)茴麻(Abutilontheophrasti)的出苗和生長有明顯的抑制作用。本研究表明,在0.067 5 kg/hm2劑量下，對(duì)紫花苜蓿的出苗和生長有明顯的抑制作用，這與Rick和Moorman[14]研究的推薦范圍有所不同，原因可能是試驗(yàn)條件不同，因此,咪唑乙煙酸用于土壤處理時(shí)要慎重。高劑量0.112 5 kg/hm2條件下，紫花苜蓿受到較長時(shí)間的抑制作用，中間劑量和低劑量條件下隨時(shí)間的推移可以解除對(duì)根瘤干物質(zhì)積累的抑制作用，紫花苜蓿根瘤等級(jí)狀況可以得到恢復(fù)或改善。試驗(yàn)進(jìn)一步表明，5.0%咪唑乙煙酸水劑的4個(gè)劑量(0.067 5、0.082 5、0.097 5和0.112 5 kg/hm2)土壤處理后10周，與對(duì)照比植株全氮量隨劑量遞增而呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，這可能與咪唑乙煙酸可以通過直接影響根瘤類菌體或間接影響寄主生理活動(dòng)、抑制其共生固氮而影響氮代謝有關(guān)。試驗(yàn)中不同劑量影響的全氮量差異并不顯著，對(duì)于除草劑影響紫花苜蓿-根瘤菌的共生固氮機(jī)理鮮見報(bào)道，其原因仍需要進(jìn)一步研究。

根瘤質(zhì)量是反映根瘤數(shù)量與大小的指標(biāo)[16]。由于除草劑本身對(duì)植株的作用，植物根際細(xì)菌對(duì)磺酰脲類和咪唑啉酮類的敏感性與此類除草劑的靶標(biāo)——支鏈氨基酸生物合成中的第1個(gè)酶即乙酰乳酸合成酶的活性有關(guān)[17-18]。除草劑殘留打破了紫花苜蓿和根部共生細(xì)菌之間的信號(hào)傳遞，影響了紫花苜蓿-根瘤菌的共生關(guān)系。本研究表明，除0.067 5 kg/hm2劑量外，其余劑量抑制時(shí)間不同，隨劑量的遞增，紫花苜蓿根瘤數(shù)、干質(zhì)量和根瘤等級(jí)與對(duì)照差異顯著，紫花苜蓿-根瘤的生長恢復(fù)程度因此不同，推測(cè)與其作用機(jī)理有關(guān)，其機(jī)理仍需深入研究。

[1]朱奇,陳彥.生物固氮在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的研究現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策[J].微生物學(xué)雜志,2003,23(5):40-43.

[2]劉永秀,張福鎖,毛達(dá)如.根際微生態(tài)系統(tǒng)中豆科植物-根瘤菌共生固氮及其在可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中的作用[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),1999,1(4):28-29.

[3]姚新春,師尚禮,王亞玲.間歇性干旱對(duì)苜蓿根瘤形成的影響[J].草地學(xué)報(bào)，2007,15(3):216-220.

[4]孫立晨,董世臣,黃立坤,等.幾種除草劑在豆科作物田除草效果及安全性測(cè)定[J].大豆科學(xué)，2009，28(5):931-934.

[5]Singh B K，Stidham M A，Shaner D L.Assay of acetohydroxy acid synthase[J].Analytical Biochemistry， 1988，171：173-177.

[6]Shaner D L， O’Connor S L.The Imidazolinone Herbicides [M].Boca Raton：CRC Press，1991：91-102.

[7]蘇少泉.我國除草劑造成作物的藥害與預(yù)防[J].現(xiàn)代農(nóng)藥,2006,5(4)：1-4,12.

[8]鄭玉蓮,許景鋼,李淑芹,等.普施特優(yōu)勢(shì)降解細(xì)菌的篩選與鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(6):40-44.

[9]Reddy K N,Hoagland R E,Zablotowicz R M.Effect of glyphosate on growth,chlorophyll, and nodulation in glyphosate-resistant and susceptible soybean (Glycinemax) varieties [J].Journal of New Seeds,2000,2(3):37-52.

[10]Wilson R G.Effect of imazethapyr on perennial grasses [J].Weed Technology,1995,9:187-191.

[11]曹麗娟，程茁，丁偉.咪唑乙煙酸對(duì)大豆根瘤菌、根瘤生長及產(chǎn)量的影響[J].科技信息，2010(9)：23-24.

[12]Wu J Y,Dastgheib F.Effects of various herbicides and surfactants on Mallow (Malvaspp.) [A].In:Proceeding II of 18th Asia-Pacific Weed Science Congress [C].Beijing: Standards Press of China,2001:589-593.

[13]武菊英,江國鏗,賈春虹.幾種除草劑和助劑對(duì)苜蓿出苗和生長的影響[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2002,4(1):52-55.

[14]Rick F,Moorman T B.A review of pesticide effects on microorganisms and microbial processes related to soil fertility[J].Journal of Production Agriculture,1989,2:14-22,49.

[15]王慶海,武菊英,江國鏗.降雨及助劑對(duì)咪唑乙煙酸藥效的影響[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2003，5(3):55-58.

[16]曾昭海,隋新華,胡躍高,等.紫花苜蓿-根瘤菌高效共生體篩選及田間作用效果[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2004,13(5):95-100.

[17]Zablotowicz R M,Reddy K N.Impact of glyphosate on theBradyrhizobiumjaponicumsymbiosis with glyphosate-resistant transgenic soybean[J].Journal of Environmental Quality,2004,33:825-831.

[18]Reddy K N，Whiting K.Weed control and economic comparisons of glyphosate-resistant, sulfonylurea-tolerant and conventional soybean (Glycinemax) systems[J].Weed Technology,2000,14:204-211.