張倩茜，張偉麗，劉鳳民，許修宏，龐丹丹

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030; 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510225; 3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院教學(xué)科研基地,廣東 廣州 510225)

柱花草屬(Stylosanthes)植物是熱帶亞熱帶地區(qū)的優(yōu)質(zhì)豆科牧草[1-2]，具有莖葉產(chǎn)量高、草品質(zhì)好、耐旱、耐酸性貧瘠土壤的特點。自20世紀(jì)60年代從東南亞國家引入我國后，柱花草被廣泛用于青飼料、草粉生產(chǎn)、放牧、水土保持、果園覆蓋和綠肥作物等[3]。近年來，隨著牧草分子技術(shù)的廣泛應(yīng)用，從基因水平研究柱花草(S.guianensis)遺傳特性的研究受到了重視。提取完整性好、純度高的柱花草總RNA，是開展柱花草基因表達(dá)調(diào)控及抗性分子機(jī)制研究的前提。目前植物RNA提取方法有很多種[4-7]，常用的提取方法有SDS-酚抽提法、CTAB法和異硫氰酸胍法等，常用的試劑盒主要有Trizol試劑盒等商品化的產(chǎn)品。但沒有一種方法是適應(yīng)所有植物RNA提取的，要根據(jù)具體的植物種類和試驗條件選擇適宜的試驗提取方法[8-12]。成熟的柱花草組織富含多糖、酚類化合物及一些尚未確定的次生代謝產(chǎn)物使得RNA提取的產(chǎn)率和純度受到影響[13]。熱研2號柱花草(S.guianensisReyan No.2)是我國亞熱帶地區(qū)的重要柱花草栽培品種，本研究采用改良SDS-酚抽提法、改良CTAB法、Trizol法和柱式植物RNAout試劑盒法等提取熱研二號柱花草總RNA，并對總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA的看家基因β-actin進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而檢測提取柱花草總RNA的純度和質(zhì)量，旨為后續(xù)的柱花草基因表達(dá)調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料和試劑

1.1.1材料 試驗材料選用熱研2號柱花草(S. guianensis cv. Reyan No.2)，材料種植在仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院試驗地盆缽中，待植株生長2個月后采集幼嫩葉片提取RNA。

1.1.2試劑和處理方法 RNase Inhibitor、DNaseⅠ、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、D2000 Marker為TaKaRa產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄所用的錨定引物Oligo(dT)18和β-actin基因片段cDNA的特異引物序列特異引物由上海生工有限公司合成，β-actin基因片段的上游引物5′-CAGTGGTCGTACAACTGGTAT-3′,下游引物5′-ATCCTCCAATCCAGACACTGT-3′，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為600 bp左右。SDS、CTAB、Tris、PVP、EDTA-Na2、NaCl和NaAc·3H2O等試劑均為國產(chǎn)分析純。

研缽、藥匙、玻璃三角瓶用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)浸泡24 h后，放入烘箱于180 ℃干熱滅菌8 h。移液槍頭、離心管等，用0.1% DEPC溶液浸泡24 h，濕熱滅菌40 min，然后放入烘箱于65 ℃烘干。電泳槽用0.4 mol/L NaOH浸泡4 h以上，以10 V/cm的電壓強(qiáng)度對電泳槽進(jìn)行電泳滅菌。

1.2總RNA提取方法

1.2.1改良SDS-酚抽提法 1)稱取0.1 g柱花草幼嫩葉片，于液氮中研磨成粉末，加入離心管中，立即加入65 ℃預(yù)熱的提取緩沖液1.5 mL(2% SDS、1.5% PVP、1% NaCl、NaAc-HAc緩沖液)和16 μL β-巰基乙醇于65 ℃水浴20 min。2)取出后加入等體積氯仿充分搖勻，4 ℃ 10 000 r/min離心25 min。3)取上清液加入1/2體積氯仿和1/2體積水飽和酚，充分搖勻8 min后4 ℃ 12 000 r/min離心20 min。4)取上清液加等體積冷異丙醇充分混勻后于-20 ℃靜置40 min。5)4 ℃ 12 000 r/min離心15 min后棄上清液，所得沉淀為總核酸樣品。6)用186 μL無RNase的ddH2O溶解后加入10×DNaseⅠbuffer 10 μL、40 U/μL的RNase Inhibitor 1 μL、5 U/μL的DNaseⅠ3 μL，于37 ℃水浴40 min。7)加入1/2體積氯仿和1/2體積水飽和酚(4 ℃保存，充分混勻后4 ℃ 12 000 r/min離心13 min(重復(fù)此步驟1次)。8)取上清液于新的離心管中，加1/10體積3 mol/L NaAc和兩倍體積的無水乙醇混勻后于-20 ℃放置40 min。9)4 ℃ 12 000 r/min離心20 min后棄上清液，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌沉淀1次，然后將沉淀保存于-80 ℃無水乙醇中。使用時棄掉乙醇，于冰盒上晾干后用50 μL無RNase的ddH2O溶解用于試驗。

1.2.2改良CTAB法 (1)取0.1 g柱花草幼嫩葉片，直接置于液氮中迅速充分地研磨成粉末狀，裝入離心管中，迅速加入1 mL預(yù)熱的65 ℃的RNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl、2.5 mmol/L EDTA-Na2、2% CTAB、2% PVP、2 mol/L NaCl)和20 μL β-巰基乙醇混勻，于65 ℃水浴30 min。期間每10 min振蕩1次，使反應(yīng)充分。(2)取出，加入等體積的氯仿∶異戊醇(V∶V=24∶1)的混合液，蓋上蓋子，上下劇烈搖動5 min，混勻。然后于4 ℃ 10 000 r/min，離心15 min。(3)小心吸取上清液至一個新的離心管，重復(fù)上述抽提步驟1次。(4)取上清液于新的離心管中，加入1/3體積的8 mol/L LiCl溶液混勻后，于4 ℃冰箱中過夜或-20 ℃放置12 h，以使RNA充分析出、沉淀。(5)4 ℃ 12 000 r/min，離心20 min，棄掉上清液，得到粗提的總RNA沉淀。(6)加入91.5 μL DEPC處理水重新溶解RNA沉淀，加入10×DNaseⅠbuffer 10 μL、40 U/μL的RNase Inhibitor 1 μL、5 U/μL的DNaseⅠ3 μL，于37 ℃反應(yīng)1 h。(7)取出加入200 μL DEPC處理水后再加入等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(V∶V∶V=25∶24∶1)的混合液，用力搖勻，于4 ℃ 12 000 r/min離心15 min(重復(fù)該抽提步驟1次)。(8)取上清液，加入兩倍體積預(yù)冷(4 ℃)無水乙醇和1/10體積3 mol/L NaAc(pH值5.2)，混勻后至于冰箱-20 ℃中40 min后，12 000 r/min離心20 min棄上清液。(9)70%乙醇洗滌沉淀1次，于冰盒上晾干(約15 min)，加入50 μL DEPC處理水溶解RNA，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3Trizol試劑盒法 Trizol試劑盒購于北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書。

1.2.4柱式植物RNAout試劑盒法 柱式植物RNAout試劑盒購于北京天澤基因工程生物技術(shù)有限公司。嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作,提取的RNA溶于DEPC水中。

1.3RNA的純度、濃度與完整性檢測 取5 μL提取的RNA樣品進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄試驗結(jié)果，以檢測RNA的完整性。測定OD230 nm、OD260 nm和OD280 nm，計算OD260 nm/OD280 nm、OD260 nm/OD230 nm以檢測RNA的純度和濃度(μg/mL)。本試驗用DU640核酸蛋白測定儀測定所提取RNA樣品的OD260 nm和OD280 nm(以無RNase水為空白液調(diào)零)。每種方法重復(fù)提取3次,分別測定后，取其平均值。根據(jù)OD260 nm/OD280 nm、OD260 nm/OD230 nm的比值分析RNA純度，用公式計算RNA產(chǎn)率(μg/g)：

RNA濃度=40×OD260 nm×稀釋倍數(shù)[14]。

1.4cDNA第一鏈的合成及看家基因β-actin的擴(kuò)增 反轉(zhuǎn)錄所用的錨定引物Oligo(dT)18，按照TaKaRa公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成柱花草葉片的cDNA第一鏈。取柱花草葉片cDNA進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增柱花草β-actin基因片段引物(上游引物5′-CAGTGGTCGTACAACTGGTAT-3′,下游引物5′-ATCCTCCAATCCAGACACTGT-3′)，cDNA模板經(jīng)94 ℃變性7 min，按94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s程序擴(kuò)增30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。以DL2000 Marker作為分子量標(biāo)記，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1不同方法提取RNA完整性檢測 瓊脂糖凝膠電泳是檢測RNA完整性與質(zhì)量的重要方法，圖1為4種試驗方法的檢測結(jié)果。改良SDS-酚抽提法提取的RNA完整性較好，兩條條帶清晰可見，并且28S帶亮度是18S帶的兩倍，但是點樣孔有少量雜質(zhì)殘留，稍有拖帶現(xiàn)象出現(xiàn)。說明該方法提取柱花草RNA雜質(zhì)去除不徹底。改良CTAB法提取的RNA的28S與18S條帶清晰明亮，28S帶亮度是18S帶的兩倍，點樣孔無雜質(zhì)殘留，表明提取的總RNA完整性好。Trizol法經(jīng)多次試驗，電泳時RNA樣品為粘稠狀，結(jié)果均未能提取到柱花草葉片的RNA。柱式植物RNAout試劑盒法可以得到完整、高質(zhì)量的RNA，有兩條清晰的條帶且無降解。點樣孔無雜質(zhì)殘留，28S帶亮度是18S帶的兩倍，且條帶豐富、清晰，沒有拖尾降解現(xiàn)象，說明得到了質(zhì)量很好的RNA樣品。

圖1 柱花草葉片凝膠電泳圖譜

2.2不同提取方法RNA純度、濃度的比較與分析 測定不同方法的RNA樣品的OD230 nm和OD260 nm、OD280 nm，改良SDS-酚抽提法、改良CTAB法及柱式植物RNAout試劑盒法所提取柱花草葉片總RNA的OD260 nm/OD280 nm分別為1.74、1.85和1.93；OD260 nm/OD230 nm分別為1.74、2.00和2.04(表1)。結(jié)果表明，改良CTAB法及柱式植物RNAout試劑盒法所提取RNA純度較高，并有效除去了蛋白、多糖、酚類物質(zhì)，可以用于深入的分子試驗。柱式植物RNAout試劑盒法的產(chǎn)率高于改良CTAB法，柱式植物RNAout試劑盒法提取RNA的質(zhì)量、純度、產(chǎn)率都好于改良CTAB法。改良SDS-酚抽提法所提取的RNA存在蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)的污染。OD260 nm/OD280 nm較小,說明有蛋白和酚存在；OD260 nm/OD230 nm小于2.0，表明有小分子或鹽存在。

2.3柱花草RNA樣品的cDNA合成及質(zhì)量檢測 把柱花草總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增β-actin基因片段，進(jìn)一步檢測所提取RNA的質(zhì)量。電泳結(jié)果顯示，CTAB法和柱式植物RNAout試劑盒法都得到了長度約為600 bp的帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。說明所提取的RNA具有較強(qiáng)的反轉(zhuǎn)錄活性。柱式植物RNAout試劑盒法比CTAB法的條帶更亮、更清晰，說明柱式植物RNAout試劑盒法所提取的RNA質(zhì)量更好，能滿足更高的實驗要求。反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進(jìn)一步說明了改良CTAB法和柱式植物RNAout試劑盒法提取的柱花草總RNA 具有較高的質(zhì)量, 可用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。

3 討論與結(jié)論

研究表明，植物組織或富含酚類化合物，或富含多糖，或含有某些尚無法確定的次級代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致未能有效地分離純化其組織中的RNA[15]。多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將它們分開。在去除多糖的同時RNA也被去除，造成RNA產(chǎn)量的減少；而在沉淀RNA時，也產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液。由于多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究[16]。在植物材料勻漿時，酚類物質(zhì)會釋放出來，氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚?，并隨氧化程度的增加而加深，這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)[17]。被氧化的酚類化合物(如醌類)能與RNA穩(wěn)定地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化[15]。

表1 不同提取方法提取的柱花草葉片總RNA的純度與產(chǎn)率

圖2 RT-TCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測

成熟的柱花草材料中富含多糖和酚類化合物，干擾了完整RNA的提取。因此提取高質(zhì)量柱花草總RNA必須要在除糖和除酚這兩個關(guān)鍵步驟上進(jìn)行良好的操作。本研究中改良的CTAB法從柱花草葉片中提取了質(zhì)量較好的總RNA，得到的RNA能夠進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并順利擴(kuò)增出看家基因，可以用于后續(xù)的分子生物學(xué)試驗。CTAB法是常用的植物RNA提取方法，CTAB陽離子的去污能力可有效地將多糖除去，并且能使RNA有效地留在水相中。本研究中進(jìn)行部分改良，通過使用LiCl沉淀劑選擇性沉淀RNA，因為LiCl沉淀劑可將干擾物質(zhì)留在上清液中[18-19]，使RNA與多糖有效分離[20]。本研究中為了應(yīng)對反復(fù)抽提過程中RNA產(chǎn)率降低的缺點，采用LiCl沉淀RNA 12 h的方法，可以有效去除柱花草中的多糖。裂解液中PVP和少量的β-巰基乙醇的加入作為強(qiáng)還原劑可以防止酚類物質(zhì)的氧化；另外在改良CTAB中的高鹽緩沖液有助于柱花草葉片中多糖的去除。

用柱式植物RNAout試劑盒法提取柱花草的RNA效果非常好，條帶清晰，純度高，提取產(chǎn)率高。柱式植物RNAout試劑盒法的效果好于改良的CTAB法，但兩種方法提取的RNA均能成功的反轉(zhuǎn)錄并都擴(kuò)增出看家基因。改良的CTAB法經(jīng)濟(jì)實惠，成本低。比較之下，柱式植物RNAout試劑盒法成本較高，但提取時間快，對于短時間內(nèi)須提取大量材料RNA的試驗非常適合。這兩種方法可根據(jù)課題實際情況應(yīng)用到后續(xù)的分子試驗研究。

Trizol試劑盒是市場上常見的試劑盒之一，本研究中TrizoL試劑法沒有提取到RNA，發(fā)現(xiàn)在異丙醇沉淀核酸時，下層液體中有一小團(tuán)粘稠透明不溶物或者是褐色物不溶物與RNA難以分離，這說明異丙醇沉淀RNA時導(dǎo)致了多糖、多酚物質(zhì)的共沉淀作用[21]。表明TrizoL試劑法不適合柱花草RNA的提取，這是因為Trizol的主要成份是異硫氰酸胍和苯酚，沒有特殊去除多糖和多酚的試劑，所以對于大多數(shù)多糖、多酚的植物無法成功提取。改良SDS-酚抽提法是常規(guī)的RNA提取方法，通過SDS處理可以去除部分多糖，在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖[16]，但即使通過這些步驟仍會發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)多的多糖與RNA混雜在一起，提取RNA效果不好，提取量少，雜質(zhì)去除不徹底，試驗過程耗時長，不適合含糖量較大的柱花草樣品的RNA提取。

本研究通過比較幾種柱花草RNA的提取方法，建立了可以獲得高質(zhì)量RNA的試驗方法(改良CTAB法與柱式植物RNAout試劑盒法)，為后續(xù)柱花草分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

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