周 菁，羅海明

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)醫(yī)院 心內(nèi)科，上海 200437)

痰濕體質(zhì)是指因先天遺傳，或后天過(guò)食肥甘等因素，而至津液運(yùn)化失司，痰濕凝聚，以黏滯重濁為主要特征的體質(zhì)狀態(tài)[1]。該體質(zhì)人群易患胸痹、消渴等病證，但其患病機(jī)制尚未完全明確。之前已有研究[2-4]報(bào)道痰濕體質(zhì)具有遺傳特異性，我們前期的研究[5]也發(fā)現(xiàn)痰濕體質(zhì)與低密度脂蛋白受體基因PvuⅡ、AvaⅡ多態(tài)性相關(guān),且這種低密度脂蛋白受體基因PvuⅡ、AvaⅡ多態(tài)性的差別直接導(dǎo)致痰濕體質(zhì)人群與平和質(zhì)人群之間血脂指標(biāo)的不同。但這項(xiàng)研究距離揭示痰濕體質(zhì)人群易患胸痹、消渴等病證的本質(zhì)原因相差甚遠(yuǎn)。瘦素(Leptin，LEP)是肥胖基因(ob)在脂肪細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物。LEP具有抑制食欲、減少脂肪合成、增加肌體耗能等作用，并對(duì)肥胖、糖尿病、心血管疾病、生殖系統(tǒng)疾病等產(chǎn)生影響。因此，痰濕體質(zhì)人群較平和質(zhì)人群更易患冠心病、Ⅱ型糖尿病等疾病的原因，是否與瘦素基因多態(tài)性相關(guān)聯(lián)值得我們進(jìn)行深入探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 全部104例研究對(duì)象均為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院自2009年1月-2010年12月收治的心血管內(nèi)科住院病人。按納入標(biāo)準(zhǔn)，分為痰濕體質(zhì)組和平和質(zhì)組[1]。其中痰濕體質(zhì)組58例，男30例，女28例,平均年齡(58.04±11.39)歲；平和質(zhì)組46例，男25例，女21例，平均年齡(58.04±11.69)歲。2組間一般情況比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 取ACD抗凝外周血1.0 mL,用北京天根生物提供的全血DNA試劑盒(DP304)提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增瘦素，上游引物：5’-TTTCCTGAATTTTCCCGTGAG -3’；下游引物:5’-AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA -3’。PCR循環(huán)參數(shù):94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性40 s、55 ℃、58 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min→4 ℃ 保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng) 取PCR產(chǎn)物5 μL加限制性內(nèi)切酶cfoI 0.5 μL,反應(yīng)體系20 μL,置37 ℃水浴2 h酶切。酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外線檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘦素基因C2549A SNP多態(tài)性基因型檢測(cè)結(jié)果 瘦素LEP2549 C/A的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為242 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶cfoI酶切后，產(chǎn)生3種基因型，即CC型、CA型、AA型。CC型顯示242 bp 1條帶，CA型顯示242 bp、181 bp和61 bp 3條帶，AA型顯示181 bp和61 bp 2條帶(見圖1)。

2.2 2組基因型分布 見表1。

表1 2組瘦素LEP2549 C/A基因型分布 例

2.3 2組等位基因頻率比較 見表2。

表2 2組瘦素LEP2549 C/A等位基因頻率比較

圖1 瘦素基因C2549 SNP多態(tài)性基因型檢測(cè)結(jié)果

3 討論

瘦素(LEP)作為一種調(diào)節(jié)分子,在糖、脂等物質(zhì)代謝過(guò)程中具有重要作用，近年的研究[6]揭示其在代謝性疾病中有重要作用。瘦素與糖尿病之間最直接的聯(lián)系莫過(guò)于瘦素與胰島素的相互作用。胰島素不僅作用在脂肪細(xì)胞上刺激瘦素分泌，同時(shí)也作用在瘦素的靶細(xì)胞上限制瘦素的功能，它可能是糖尿病發(fā)病早期代償性高胰島素血癥和“瘦素抵抗”相伴發(fā)的原因之一。瘦素與胰島素抵抗密切相關(guān),胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病的重要致病因素之一。鑒于瘦素基因的生物活性及其基因多態(tài)性特點(diǎn),可能瘦素基因是Ⅱ型糖尿病的候選基因之一。

此外，瘦素與血脂代謝異常及冠心病密切相關(guān)。大量研究[7]表明，瘦素促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成除了增加清道夫受體外,還與以下病理過(guò)程有關(guān)：1)瘦素增加巨噬細(xì)胞?；o酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的蓄積，加速泡沫細(xì)胞的形成，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[8]。2)瘦素增加3-羥基-3·甲基戊二酰輔酶A還原酶的活性，從而增加單核細(xì)胞中內(nèi)源性膽固醇的合成，有助于泡沫細(xì)胞和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[9]。3)瘦素激活磷脂酰肌醇-3激酶使巨噬細(xì)胞活化后，不僅使細(xì)胞內(nèi)脂肪組織分化相關(guān)蛋白表達(dá)增加，而且使細(xì)胞質(zhì)中富含脂肪組織分化相關(guān)蛋白的脂滴形成增加。細(xì)胞內(nèi)脂肪組織分化相關(guān)蛋白表達(dá)的增加，將促進(jìn)中性脂肪如三酰甘油和膽固醇在細(xì)胞內(nèi)的沉積而減少它們的流出，增加脂滴對(duì)脂解作用的穩(wěn)定性[10]。這些病理過(guò)程均有助于泡沫細(xì)胞的形成，加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。因此瘦素與動(dòng)脈粥樣硬化以及冠心病的發(fā)生息息相關(guān)。且研究[11]發(fā)現(xiàn)瘦素基因A-2549C多態(tài)性與個(gè)體空腹血漿瘦素水平相關(guān)。因此，瘦素基因多態(tài)性可能也是導(dǎo)致冠心病的原因之一。

因瘦素基因多態(tài)性與糖尿病/冠心病等疾病的發(fā)生密切相關(guān),而痰濕體質(zhì)人群較平和質(zhì)人群更易患糖尿病/冠心病等疾病，因此,痰濕體質(zhì)是否與瘦素基因多態(tài)性相關(guān)吸引著我們的關(guān)注。

本課題研究發(fā)現(xiàn)，瘦素LEP2549 C等位基因頻率痰濕體質(zhì)組高于平和質(zhì)組，但2組間統(tǒng)計(jì)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。該結(jié)果提示，痰濕體質(zhì)與瘦素基因2549C/A SNP多態(tài)性有某種程度的相關(guān)，但依據(jù)目前結(jié)果暫不能將該基因多態(tài)性作為區(qū)分2種體質(zhì)人群的遺傳標(biāo)志物，2種體質(zhì)人群間的差異性仍需我們擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行深入研究。

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