李 健，王曉梅

(1.寶雞市人民醫(yī)院 腫瘤科，陜西 寶雞 721000；2.寶雞文理學(xué)院 化學(xué)化工系,陜西 寶雞 721013)

糖尿病是以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，久病可引起多系統(tǒng)的損害，隨著人們生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率日趨增高，在治療中，降低餐后血糖以減少并發(fā)證的發(fā)生是一個(gè)重要的方面。中藥治療糖尿病雖然降糖強(qiáng)度較西藥弱，但療效穩(wěn)定，作用溫和，不良反應(yīng)少，能有效防治并發(fā)證。近年來(lái)，從中藥及其提取物中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究引起了很多學(xué)者的關(guān)注并取得了一些進(jìn)展[1-3]。川芎嗪，化學(xué)名為四甲基吡嗪，是從川芎的生物堿中分離得到的有效單體，具有活血化瘀、抗血小板凝集、擴(kuò)張血管等多種作用，因其治療心腦血管疾病療效好、不良反應(yīng)少而廣泛用于臨床[4-5]。天麻素是天麻的主要活性成分之一,化學(xué)名為對(duì)羥甲基苯-β-D-呋喃葡萄糖苷。天麻素具有鎮(zhèn)靜、安眠和鎮(zhèn)痛等作用，并有舒張外周血管、增加心腦血管流量、降低腦血管阻力等作用[6-7]。然而，有關(guān)二者對(duì)α-葡萄糖苷酶的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組就川芎嗪和天麻素對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)觀察，以期對(duì)糖尿病藥物的篩選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

注射用磷酸川芎嗪，山東圣魯制藥有限公司，批號(hào)：20059313；天麻素注射液，上?，F(xiàn)代哈森(商丘)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20066464；α-葡萄糖苷酶，美國(guó)Sigma公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG,純度99%)，美國(guó)Merck公司；二甲基亞砜，萊陽(yáng)化工實(shí)驗(yàn)廠；所用化學(xué)試劑均為市售分析純，去離子水自制。

DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司;752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；BS-244-SS電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 天麻素和川芎嗪對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響 參照文獻(xiàn)方法[8]測(cè)定天麻素和川芎嗪對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響。酶活力單位的定義:37 ℃、pH 6.8條件下，每分鐘水解pNPG釋放1 μmol對(duì)硝基酚(pNP)所需的酶量，規(guī)定為一個(gè)酶活力單位(U)。

取10 mL試管若干，依次加入pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液1.85 mL、0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶50 μL，不同濃度樣品溶液(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mg/mL)50 μL，0.011 6 mol/L pNPG 50 μL，將上述反應(yīng)體系在37 ℃恒溫水浴保溫30 min后，立即加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液8 mL終止反應(yīng)，以磷酸鹽緩沖液為參比，在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A。樣品終濃度分別為0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5及20 μg/mL，每個(gè)濃度同時(shí)作3個(gè)平行,取平均值。同時(shí)測(cè)樣品及底物的本底吸光度并于計(jì)算時(shí)扣除。按照公式計(jì)算樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

式中：A樣品為加入樣品后酶促反應(yīng)的吸光度值，A空白為無(wú)樣品時(shí)酶與底物反應(yīng)后的吸光度值，且均為扣除本底吸光度的值。

2.2 抑制物的抑制動(dòng)力學(xué)研究 分別取不同濃度(0、5、15 μg/mL)的樣品溶液，再分別加入不同濃度的底物(濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mol/L)，測(cè)定反應(yīng)速度，用Lineweave-Burk作圖法確定抑制類型。

3 結(jié)果

3.1 天麻素、川芎嗪對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響 見(jiàn)圖1。由圖1可知,在一定濃度范圍內(nèi)，天麻素和川芎嗪溶液對(duì)α-葡萄糖苷酶活性均有抑制作用，且抑制作用隨提取物濃度的增大而增大，川芎嗪溶液在20 μg/mL時(shí)抑制率達(dá)84.0%，IC50值為3 μg/mL。天麻素濃度為2.5 μg/mL時(shí)，抑制率為55.9%，天麻素濃度為15 μg/mL時(shí)，抑制率達(dá)89.1%，之后抑制率無(wú)明顯增大。IC50值為2.4 μg/mL。

圖1 天麻素、川芎嗪對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖2 川芎嗪對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)制的判斷

圖3 天麻素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)制的判斷

3.2 川芎嗪對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)制的判斷 見(jiàn)圖2。由圖2可知,通過(guò)在含不同濃度樣品川芎嗪的測(cè)活體系中，改變底物濃度，測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，得到一組相交于縱軸一點(diǎn)的直線，斜率隨樣品濃度的變化而改變，最大反應(yīng)速度(Vm)不因樣品濃度的不同而改變，米氏常數(shù)(Km)隨著樣品濃度的增大而減小，其抑制機(jī)制符合競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型的特征。

3.3 川芎嗪對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制機(jī)制的判斷 見(jiàn)圖3。由圖3可知,通過(guò)在含不同濃度天麻素的測(cè)活體系中，改變底物濃度，測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，得到一組相交于左上象限一點(diǎn)的直線，斜率隨樣品濃度的變化而改變，最大反應(yīng)速度(Vm)因樣品濃度的不同而改變，米氏常數(shù)(Km)隨著樣品濃度的增大而減小，其抑制機(jī)制既不符合競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型，也不符合非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特征，當(dāng)屬于混合型抑制類型。

4 討論

α-葡萄糖苷酶是位于小腸絨毛膜上的消化酶，其將飲食中的淀粉和蔗糖分解為單糖而被吸收。α-葡萄糖苷酶抑制劑可抑制位于小腸的α-葡萄糖苷酶的活性，使淀粉類分解為葡萄糖的速度減慢，延緩或抑制葡萄糖的吸收，有效地降低餐后高血糖。本實(shí)驗(yàn)的原理是糖苷酶可以與底物PNPG特異性結(jié)合，水解PNPG中的α-1，4糖苷鍵并產(chǎn)生PNP，PNP在400 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。

川芎嗪在結(jié)構(gòu)上有多個(gè)甲基，且甲基上的氫具有活性，容易與蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，在酶促反應(yīng)體系中，川芎嗪的甲基可能是通過(guò)與α-葡萄糖苷酶活性中心的“疏水口袋”結(jié)合而減少了底物與酶的結(jié)合進(jìn)而對(duì)底物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。天麻素結(jié)構(gòu)與PNPG結(jié)構(gòu)相似，二者均有苯基和葡萄糖結(jié)構(gòu)，在酶促反應(yīng)中，天麻素可以與PNPG競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合酶活性中心的必需基團(tuán)，從而減少了PNP的產(chǎn)生,同時(shí)天麻素含有多個(gè)羥基，并有甲基，這些基團(tuán)可能與酶蛋白活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合，從而引起變構(gòu)效應(yīng)，也阻礙了α-葡萄糖苷酶水解PNPG的進(jìn)程，由此產(chǎn)生了對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

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