李必富，王曉佳，楊金福，湯 承

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，動物醫(yī)學(xué)四川省高等院校重點建設(shè)實驗室，四川成都610041)

犬皮膚真菌病是寄生于犬被毛與表皮、趾爪角質(zhì)蛋白組織中的真菌引起的以皮膚瘙癢、紅斑性脫毛、丘疹、膿包、結(jié)痂、皮屑等為特征的各種皮膚病.它是一種人畜共患病，可通過直接和間接接觸傳播給人類.近年來中國寵物犬的飼養(yǎng)數(shù)量大幅增加，犬源皮膚真菌通過接觸感染人的機會大大增加，犬已經(jīng)成為人真菌病的重要傳染源.寵物病原真菌主要是小孢子屬和毛癬菌屬成員［1］，目前國內(nèi)報道犬的真菌性皮膚病中絲狀真菌的感染率最高，其病原體70%是犬小孢子菌，20%是石膏樣小孢子菌，10%是須發(fā)毛癬菌［2］，尚未見致病性黑曲霉菌的研究報告.國內(nèi)目前對動物病原真菌的鑒定主要是采用分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定，但該方法對形態(tài)相近的真菌難以準(zhǔn)確鑒別，而分子鑒定則顯示出其巨大的優(yōu)勢.真菌在rDNA-ITSA區(qū)段既具有保守性，又在屬間及種間存在廣泛的多態(tài)性，利用這一特性進行PCR擴增及序列分析已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物病原真菌鑒定.作者從皮膚病患犬病灶中分離出一株真菌，經(jīng)核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)基因克隆測序鑒定為黑曲霉，并對其培養(yǎng)特性、耐藥性及致病性等生物學(xué)特性進行了研究，為犬源真菌病的診療提供參考.

1 材料與方法

1.1 臨床病例和小鼠

2歲棕色雄性貴賓犬，表現(xiàn)為皮膚瘙癢，背部和尾部脫毛、皮膚出現(xiàn)紅色丘疹.成年雄性昆明鼠購自四川大學(xué)實驗動物中心.

1.2 培養(yǎng)基和試劑

PCR Master Mix購自天根生物有限公司;JM109感受態(tài)細胞購自奧克公司;PMD19載體購自日本TaKaRa公司;膠回收試劑盒購自天根生物有限公司.地塞米松由鄭州卓峰制藥廠生產(chǎn)，沙堡培養(yǎng)基和兩性霉素B、伊曲康唑膠囊、酮康唑、制霉菌素、氟康唑等5種抗真菌藥敏紙片購自杭州微生物制品有限公司.

1.3 引物

參照文獻［3］設(shè)計的位于18 S區(qū)域的上游引物和文獻［4］設(shè)計的位于28 S區(qū)域的下游引物，擴增包含真菌 rDNA 18 S和28 S的部分區(qū)域和ITS1，5.8 S，ITS2 的完整區(qū)域的片段，上下游引物序列為:5’-tccgtaggtgaacctgcgc-3’，5’-tcctccgcttattgatatgc-3’，引物由上海生物工程公司合成.

1.4 真菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

將患部用酒精仔細清潔消毒后用刀片刮取患部皮屑和組織，接種于沙堡平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1周，觀察菌落特征，并將分離出的真菌采用載片培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)72 h，觀察菌體形態(tài).

1.5 ITS區(qū)的PCR擴增

收集沙堡平板72 h真菌培養(yǎng)物，加入液氮研磨，用酚-氯仿法提取真菌總DNA，進行ITS區(qū)的PCR 擴增.體系:PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各 1 μL，DNA 模版1 μL，無菌水補足至25μL.擴增反應(yīng)條件為:95℃ 7 min，95 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min 30 s，35 個循環(huán);72℃10 min;16℃保存;結(jié)束反應(yīng).PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)成像觀察電泳結(jié)果.

1.6 克隆測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

按照膠回收試劑盒說明書將擴增片段進行純化，連接T載體并轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細胞，陽性克隆送上海英俊公司測序.用DNAStar 7.1.0版DNA分析軟件中的MegAlign軟件對ITS區(qū)基因序列進行同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，自舉值為1 000.

1.7 藥敏試驗

將孢子濃度為1×106CFU·mL-1的真菌涂布于沙堡平板培養(yǎng)基，并將藥敏片平貼于培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，測定抑菌圈大小，并按照說明書提供的標(biāo)準(zhǔn)判斷其對藥物的敏感性(表1).

表1 抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn)Table1 Interpretation of the standard zone of inhibition

1.8 致病性試驗

參照文獻［5，6］報道的方法，12只小鼠首先肌肉注射地塞米松，0.2 g·只-1，連續(xù)注射8 d，使小鼠處于免疫抑制狀態(tài).隨后將小鼠分為3組，每組3只，第1組經(jīng)腹腔注射途徑感染，5×105CFU·只-1，第2組經(jīng)皮膚感染，具體做法是首先將小鼠背部刮毛，大小約為2 cm2，再用刀片刮無毛區(qū)皮膚至輕微破損，立即用蘸取真菌孢子的棉簽涂抹，5×105CFU·只-1，第3，4組以生理鹽水代替真菌孢子分別經(jīng)腹腔和皮膚進行處理，作為空白對照組.隔離飼養(yǎng)于SPF鼠籠中，觀察記錄小鼠的臨床癥狀及病理變化至第4周，并于試驗結(jié)束后撲殺小鼠，觀察皮膚及內(nèi)臟病變，采集病料進行真菌分離培養(yǎng).

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)特性

在沙堡瓊脂平板上37℃ 24 h可見白色絨毛狀菌落，以后迅速蔓延，菌絲體為白色，48 h達到孢子成熟階段，隨著孢子的形成而逐漸變?yōu)橹醒氤屎谏窠q狀菌落，中心可見孢子形成的黑色顆粒，有環(huán)狀溝紋;載片培養(yǎng)物鏡檢可見菌絲發(fā)達而多分枝，頂端可見大球型頂囊，分生孢子頭呈黑褐色放射狀宛若“菊花”(圖1)，為典型的黑曲霉菌落及形態(tài)特征.

圖1 黑曲霉的菌落及菌體特征Fig.1 The colony and morphological characteristics of Aspergillus niger

2.2 r DNA-ITS區(qū)的鑒定結(jié)果

從真菌分離株(SC-8)中擴增出1條約600 bp的條帶(圖2)，測序結(jié)果顯示擴增片段大小為599 bp，與GenBank中的黑曲霉ITS區(qū)基因序列的同源性為94.1% ～100%(圖3)，是黑曲霉的特異片段，證實分離菌株為黑曲霉(Aspergillus niger SC-8).

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，Aspergillus niger SC-8和巴西人源分離株(FJ810501)以及意大利人源分離株(GQ359407)聚為1支(圖4).

2.3 藥敏試驗結(jié)果

Aspergillus niger SC-8對兩性霉素和制霉菌素高度敏感，對酮康唑中度敏感，而對氟康唑和伊曲康唑耐藥.

圖2 真菌分離株的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 The results of PCR identification of Aspergillus niger

2.4 致病性

以生理鹽水處理的小鼠在試驗期間精神、食欲正常，被毛光順，皮膚出現(xiàn)瘙癢和紅腫現(xiàn)象.而經(jīng)皮膚和經(jīng)腹腔感染小鼠各有1只出現(xiàn)皮膚瘙癢、發(fā)紅、滲出和脫毛現(xiàn)象，與犬自然感染病變相似(圖5).剖檢可見該小鼠脾臟有白色霉菌結(jié)節(jié)(圖6)，從該部位和患部皮膚均分離出真菌，經(jīng)PCR擴增和測序證實為黑曲霉.

3 討論

本研究從皮膚病患犬分離出真菌，經(jīng)過rDNAITS基因序列測定和動物試驗，確診該犬的皮膚病是由黑曲霉引起的.曲霉菌感染可引起人和動物的淺部真菌病［7］，ELAD 等［7］還發(fā)現(xiàn)土曲美可引起犬的彌散性真菌病.而深部感染的報道并不多見，國內(nèi)尚未見黑曲霉感染犬的報道.真菌多為條件性致病菌，常于機體免疫功能低下時繼發(fā)感染或與其他病原混合感染，加重病情，增加死亡率.近年來，中國人和動物的免疫缺陷性疾病發(fā)病率不斷升高，隨著中國寵物養(yǎng)殖數(shù)量的不斷增長，犬只與人類的接觸更為密切，感染人的機會大大增大，犬已經(jīng)成為人類真菌性皮膚病的重要傳染來源.本研究發(fā)現(xiàn)犬源黑曲霉rDNA-ITS基因與人源黑曲霉具有高度的同源性，且對制霉菌素和兩性霉素具有耐藥性，其公共衛(wèi)生學(xué)意義值得關(guān)注.

基于ITS間隔區(qū)的片段序列擴增及序列測定可準(zhǔn)確鑒定動物病原真菌.西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)四川省高等院校重點建設(shè)實驗室通過對不同研究報告中的上下游引物序列進行優(yōu)化組合，擴增真菌rDNA-ITS區(qū)約599 bp的片段，通過測序和序列分析，將該實驗室分離的41株犬源皮膚真菌分為15個屬，16個真菌小種，其中3株為黑曲霉菌［8］.證明基于ITS區(qū)序列的分子鑒定技術(shù)對犬源真菌的鑒定廣泛適用.

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