王鳳雪，溫永俊，劉 準，冷 雪，李真光，武 華，2

(1.中國農業(yè)科學院特產研究所，吉林 吉林132109;2.北京必威安泰生物科技有限公司，北京100176)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)主要以母豬發(fā)熱、厭食、早產、流產、死胎、弱仔等繁殖障礙及各種年齡豬呼吸系統(tǒng)疾病、仔豬高死亡率、感染豬出現免疫抑制等為主要特征［1］，其病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV).20世紀80年代末期在美國和歐洲一些國家發(fā)現該?。?］.在1995年在中國多個省發(fā)現該病，郭寶清等［3］、楊漢春等［4］于 1996年分別從疑似PRRS的病例中分離出PRRSV.從2006年開始發(fā)生的豬高熱病，是由PRRSV變異株引起的一種急性高致死性疫病，給中國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經濟損失［5］.PRRSV是一種單股、正鏈的RNA病毒，基因組全長約15 kb，具有8個開放閱讀框(ORFs).根據病毒基因組的差異，PRRSV可分為2個基因型:歐洲型(以LV株為代表株)和美洲型(以ATCC VR-2332株為代表株).5'端長約12 kb的基因組ORF1(包括ORF1a和ORF1b)編碼病毒復制酶和聚合酶等;3'端有6個讀碼框，編碼 PRRSV的6種結構蛋白.PRRSV ORF1a和ORF1b 編碼非結構蛋白 Nsp1 ～ Nsp12［6，7］，核苷酸和推導的氨基酸序列分析表明Nsp2是PRRSV高變區(qū).Nsp2基因中可見點突變、核苷酸插入或突變等多種基因變化，這種情況不僅存在于北美與歐洲基因型之間，而且在同型之間也是如此［8～14］.本研究根據病毒分子生物學原理，以分離于天津豬場的PRRSV TJ株及其致弱毒TJM株為研究對象，對易變區(qū)非結構蛋白Nsp2進行分子克隆測序及結構的分析，旨在為進一步研究該病毒的致病機理、毒力變化及致弱等提供基礎.

1 材料與方法

1.1 病毒

PRRSV TJ株由中國農業(yè)科學院特產研究所人獸共患病研究室分離、鑒定、保存.TJM株系由TJ株在敏感細胞系Marc-145細胞上傳代至92代獲得.MARC-145細胞，由中國農業(yè)科學院特產研究所人獸共患病研究室保存.

1.2 主要試劑

各種限制性內切酶，ExTaq DNA Polymerase，dNTP，AMV反轉錄酶，T載體試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司.RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司.其余試劑為國產分析純產品.

1.3 菌種與載體

大腸桿菌DH5α由中國農業(yè)科學院特產研究所人獸共患病研究室提供，pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司.

1.4 引物

根據VR-2332美洲株基因組，設計1對引物擴增包括非結構蛋白Nsp2的一段基因，預期擴增片段3 602 bp，引物由英維捷基(上海)貿易有限公司(Invitrogen)公司合成，具體引物序列如下:Nsp2-F:5’-CAGGGTTGAGCCCAATACG0-3’，Nsp2-L:5’-GCAAGGCAGCAATGAGGTG-3’.

1.5 病毒RNA的提取

按照Invitrogen公司RNA提取試劑Trizol使用說明進行.

1.6 RT-PCR 反應

1.6.1 反轉錄(RT)20μL反轉錄體系中，反轉錄引物OligodT 1 μL，RNA 5 μL，70 ℃加熱10 min，冰浴10 min;再加入5 倍 AMV buffer 4 μL，10 mmol·L-1dNTP 2 μL，RNasin 0.5 μL，AMV 反轉錄酶 1 μL，DEPC H2O 6.5μL，充分混合后離心，經42℃ 60 min，95℃滅活AMV反轉錄酶，立即于冰上冷卻，進入PCR.

1.6.2 PCR 反轉錄產物5μL，10倍 PCR buffer 5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 4 μL，上下游引物各 1 μL，ExTaq DNA Polymerase 0.5 μL，加水補足 50 μL.優(yōu)化PCR循環(huán)參數，確定PCR的最佳反應程序為:95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，56.6 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min 30 s，35個循環(huán)，72 ℃ 延伸 10 min.取 5 μL PCR產物，進行質量分數為0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察產物擴增效果和片段大小.

1.7 PCR產物的克隆與測序

將擴增的各基因產物分別回收后與載體pMD18-T連接，轉化DH5α感受態(tài)細胞，經Amp+抗性篩選，酶切鑒定正確的克隆送英維捷基(上海)貿易有限公司測序.

1.8 Nsp2基因的序列分析

使用DNAStar和Clustal W軟件對PRRSV TJ株和TJM株Nsp2基因進行分析，并與標準參考毒株序列進行比較;使用RNAdraw，MFOLD等軟件，以最佳結構或堿基配對性的矩陣算法，對2級結構進行預測，并深入分析它們的協(xié)同變異性，進而分析它們的衍化關系.

2 結果與分析

2.1 PRRSV Nsp2的RT-PCR擴增

以PRRSV TJ株和TJM株RNA為模板合成第一鏈cDNA，利用所設計的引物對Nsp2-F與Nsp2-L，PCR反應擴增出目的片段，PRRSV TJ株Nsp2大小與預期結果一致，而細胞致弱毒株TJM株Nsp2偏小(圖1).

2.2 PRRSV Nsp2編碼區(qū)PCR產物的克隆鑒定

2個毒株的Nsp2的RT-PCR產物經克隆、轉化及酶切鑒定，得到目的片段為3 602 bp，證明獲得了PRRSV陽性重組子(圖2).

2.3 PRRSV TJ株和TJM株Nsp2的結構分析

2.3.1 1級結構分析 測序結果與北美型經典代表株VR-2332株Nsp2比較發(fā)現，PRRSV TJ株Nsp2長2 850 bp，與VR-2332株Nsp2(2 940 bp)相比有較大差異，核苷酸序列同源性只有83.6%;推導氨基酸同源性77.9%.TJM株與VR-2332的核苷酸序列同源性為82.9%，推導氨基酸同源性為75.5%.與經典株VR-2332相比，PRRSV高致病性毒株TJ株Nsp2基因具有特征性的不連續(xù)的30個氨基酸(90個堿基)的缺失，這也是最近多個研究機構分離的高致病性 PRRSV 毒株的共性［15，16］.來源于 TJ株的細胞致弱毒株TJM株Nsp 2的序列除了具有該共性以外，還出現了另一段120個氨基酸(360個堿基)的整段缺失(圖3).

2.3.2 2級結構分析 運用 RNAdraw軟件對PRRSV TJ分離株、PRRSV TJM分離株和經典毒株VR-2332基因組RNA中Nsp2的2級結構進行預測，結果見圖4.從圖4可知，PRRSV TJ株Nsp2可形成多種形態(tài)的結構域，多數是簡單的莖環(huán)結構，也有2個內部環(huán)或幾十個堿基組成的發(fā)夾結構;TJM株Nsp2在結構上比TJ株少了1個大的分支;而經典株VR-2332的結構域和莖環(huán)結構與本試驗毒株相比均有很大的不同，這也充分說明Nsp2是PRRSV基因組中變異性比較大的區(qū)域之一.

3 討論

1)在PRRSV分子生物學研究中，通過核苷酸測序和推導的氨基酸序列比較分析表明，Nsp2是PRRSV高變區(qū)，Nsp2編碼區(qū)中核苷酸的點突變、堿基單個或多個的插入與缺失普遍存在于北美洲型與歐洲型PRRSV.基因組最長的PRRSV疫苗株SP的Nsp2氨基酸與北美洲型和歐洲型的Nsp2相比，分別在近C端插入了36和155個氨基酸［10］.而日本分離株EDRD-1除了像SP一樣插入了一段完全不同的108個堿基，還多了一段117個堿基的缺失［11］.北美洲基因型一般與標準毒株VR-2332比較，HB-2(sh)/2002株Nsp2在不同的位置缺失12個氨基酸［12］;而 MN184株 Nsp2在 324～434，486和505～523位發(fā)生111，1和19個氨基酸的不連續(xù)缺失［8］;2006年引起中國高致病性藍耳病的PRRSV流行株的共性是在480和531～559位發(fā)生30個氨基酸的不連續(xù)缺失.本研究中高致病性PRRSV TJ株也存在同樣的缺失，其細胞致弱株TJM株Nsp2在此缺失仍然存在的情況下發(fā)生了進一步的片段缺失，該段缺失為120個氨基酸整段缺失，比以往發(fā)現的PRRSV毒株Nsp2缺失片段都大.推測TJM株Nsp2蛋白的這120個氨基酸的缺失可能與PRRSV的毒力致弱有關.PRRSV歐洲株Nsp2序列也存在相似的缺失或插入情況.與LV相比，SD01-08株和 EuroPRRSV的 Nsp2在氨基酸734～750位之間有17個缺失(51個核苷酸)，并且推測歐洲型Nsp2氨基酸缺失區(qū)及氨基酸高變區(qū)是免疫重要區(qū)［13，14］.

圖3 TJ株和TJM株Nsp2編碼區(qū)氨基酸序列與經典株VR-2332 Nsp2編碼區(qū)氨基酸序列比較Fig.3 The deletion of Nsp2-coding region of TJ and-TJM comparing to VR-2332

圖4 PRRSV TJ株(A)，TJM株 (B)，VR-2332株(C)Nsp2 RNA 2級結構預測比較Fig.4 Analysis of secondary structure of the Nsp2 of PRRSV TJ strain(A)，TJM strain(B)and VR-2332 strain(C)

2)PRRSV基因組為單股正鏈RNA，具有感染性.核酸分子RNA是單鏈結構，單鏈RNA的三維結構是由它的核苷酸序列決定的.目前RNA2級結構預測有2種主要的方法，一是基于序列比較的方法，另一種方法是能量最小化方法.能量最小化方法在預測RNA分子2級結構時，試圖對RNA折疊的自由能進行最小化，進而搜索最穩(wěn)定的結構.Zuker的Mfold程序是使用較多的程序包之一，它就是通過一系列的最近鄰能量規(guī)則來計算一個結構的能量.通過軟件預測發(fā)現，PRRSV TJ株Nsp2可形成多種形態(tài)的結構域，從5’端開始包括占多數的莖環(huán)結構，也有2個內部環(huán)或幾十個堿基組成的發(fā)夾結構，整個Nsp2 RNA結構較為緊湊，結構主線較直;細胞致弱株TJM株Nsp2在結構上比TJ株少了1個分支，有更多的發(fā)夾結構，結構主線分叉明顯;而經典株VR-2332的結構域和莖環(huán)結構與本試驗毒株TJ和TJM相比均有很大的不同，看起來更簡單，這也充分說明Nsp2是PRRSV基因組中變異性比較大的區(qū)域之一.

［1］ 劉光清.豬繁殖與呼吸綜合征研究進展［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2001，23(1):72-75.

［2］ KEFFABER K K.Reproductive failure of unknown etiology［J］.Am Assoc Swine Pract Newsletter，1989，1(2):1-9.

［3］ 郭寶清，陳章水，劉文興，等.從疑似PRRS流產胎兒分離PRRSV的研究［J］.中國畜禽傳染病，1996，18(2):1-4.

［4］ 楊漢春，管山紅，尹曉敏，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離與初步鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志，1997，(10):9-10.

［5］ 徐 輝，李曉成，陳偉杰，等.“豬高熱病”的流行病學調查與主要病因分析［J］.中國動物檢疫，2007(6):19-21.

［6］ MEULENBERG J M，PETERSEN D A，KLUYVER E P，et al.Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to7 of Lelystad virus［J］.Virology，1995，206:155-163.

［7］ MARDASSI H，MOUNIR S，DEA S.Molecular analysis of the ORF3-7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus，Quebec reference strain［J］.Arch Virol，1995，140:1405-1418.

［8］ HAN J，LIU G，WANG Y，et al.Identification of nonessential regions of the Nsp2 replicase protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain VR-2332 for replication in cell culture［J］.J Virol，2007，81(18):9878-9890.

［9］ ALLENDE R，LEWIST L，LU Z，et al.North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome viruses differ in non-structural protein coding regions［J］.J Gen Virol，1999，80:307-315.

［10］ SHEN S，KWANG J，LIU W，et al.Determination of the complete nucleotide sequence of a vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and identification of the Nsp2 gene with a unique in sertion［J］.Arch Virol，2000，145(5):871-883.

［11］ YOSHII M，OKINAGA T，MIYAZAKI A，et al.Genetic polymorphism of the Nsp2 gene in North American type:porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Arch Virol，2008，153(7):1323-1334.

［12］ GAO ZQ，GUOX，YANGH C.Genetic characterization of two Chinese isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Arch Virol，2004，149(7):1341-1351.

［13］ FANG T，KIM D Y，ROPP S，et al.Heterogeneity in Nsp2 of European-like porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolated in the United States［J］.Virus Res，2004，100(2):229-235.

［14］ ROPPSL，WEESC E M，FANG Y，et al.Characterization of emerging European-like porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the United States［J］.JVirol，2004，78(7):3684-3703.

［15］ TIAN K，YU X ，ZHAO T，et al.Emergence of fatal PRRSV variants:unparalleled outbreaks of atypical PRRSin China and molecular dissection of the unique hallmark［J］.Plos One，2007，2(6):526-541.

［16］LI Y，WANG X，BO K，et al.Emergence of a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in the Mid-Eastern region of China［J］.Vet J，2007，174(3):577-584.