鐘 蓓,楊玉瑩 (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,湖北荊州434025)

張西臣 (吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長春130062)

顧玉芳,陳振威,多 婷 (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,湖北荊州434025)

布魯氏菌病是由布氏桿菌 (Brucella abortus)引起的導(dǎo)致感染動物流產(chǎn)、不孕不育、生殖器官病變的人畜共患傳染病,我國大部分地區(qū)都有此病的存在及流行。近年來,其疫情形勢更為嚴(yán)峻,僅2009年發(fā)病率同2008年相比即上升25.37%[1],此病成為人類發(fā)病數(shù)上升速度最快的傳染病之一[2]。布氏桿菌是革蘭氏陰性胞內(nèi)寄生菌,人感染此病后需長期服用抗生素,易產(chǎn)生耐藥性及副作用。因此消除布魯氏菌病成為公共健康計劃中最重要的目標(biāo)之一[3]。目前我國廣泛使用的疫苗有牛S19、羊Rev.1和牛RB51,這些疫苗的使用對當(dāng)?shù)氐钠贩N都有較好的效果,但現(xiàn)有的疫苗始終存在不安全、不穩(wěn)定、且不能與野毒株相區(qū)分等缺點。因此,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研制新型分子標(biāo)記苗和基因工程苗成為該病疫苗研究的必然趨勢。

布氏桿菌胞質(zhì)結(jié)合蛋白 (Periplasmic binding protein,PBP39)作為良好的T細(xì)胞抗原,被認(rèn)為是DNA疫苗的免疫抗原候選分子。本研究將布氏桿菌抗原基因pbp39和標(biāo)記基因p276克隆入大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體pMV361中,構(gòu)建重組pMV361-pbp39-p276質(zhì)粒,為布氏桿菌分枝桿菌疫苗的研制提供了前提條件。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

穿梭表達(dá)質(zhì)粒pMV361(Stover博士構(gòu)建)由吉林大學(xué)張西臣教授惠贈,E.coli DH5α、布氏桿菌、重組克隆質(zhì)粒PMD 18-T-p276為長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物病原與分子生物學(xué)實驗室保存,PMD 18-T simple vector為 Takara公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶為Fermentas公司產(chǎn)品;DNA mareker DL2000、DL250+、T4-DNA ligense、凝膠回收試劑盒為上海捷瑞生物公司產(chǎn)品;質(zhì)粒少量提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品;限制性內(nèi)切酶EcoR I,Hpa I,Nhe I為Fermentas公司產(chǎn)品。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank提供的序列,使用Primer 5.0分別設(shè)計pbp39和p276基因序列的上游引物和下游引物。在pbp39基因的上、下游引物中分別引入EcoR I、H pa I酶切位點。在p276基因的上、下游引物中分別引入Hpa I、Nhe I酶切位點,并分別在NCBI進(jìn)行Blaster查看引物的特異性,引物序列為:P1:5'-TAGAATTCATGGGCGCCTGTTGCCAATGC-3';P2:5'-GCGTTAACTATTTTGCGGCTTCAACCGCC-3';G1:5'-TACATGTTAACGATTTAGCCGACCAAACAGCA-3';G2:5'-ATGCTAGCTTAATAGGGCCTTATAAGAAGGTC -3'。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 布氏桿菌基因組DNA的提取及純化

布氏桿菌 B株接種胰蛋白胨斜面培養(yǎng)基,于 37℃培養(yǎng) 2～3d。消化液 (100mmol/L NaCl,10mmol/L T ris-HCl pH 8.0,25mmol/L EDTA pH 8.0,0.5%SDS)清洗細(xì)菌,沸水煮10min裂解細(xì)菌,加入蛋白酶K至終濃度為200μ g/mL,55℃溫育5～6h,其間需振蕩EP管。加入 500μ L苯酚∶氯仿∶異戊醇 (25∶24∶1)抽提2次,再加入500μ L氯仿∶異戊醇 (24∶1)抽提1次。水相用1/8上清體積的5mol/L NaCl和2倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀。70%乙醇洗滌沉淀2次,干燥后溶于滅菌ddH2O中。

1.5 目的基因的擴增

分別以提取的布氏桿菌全基因組DNA和PMD 18-T-p276質(zhì)粒作為模板,擴增全長為1206bp的pbp39基因和276bp的p276基因。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,94℃55s;65℃1min;72℃1min30s,30個循環(huán);72℃延伸10min。

1.6 含pbp39-p276融合基因的重組穿梭載體的構(gòu)建

用EcoR I,Hpa I對經(jīng)PCR擴增獲得的pbp39基因片段進(jìn)行雙酶切,克隆入經(jīng)相同內(nèi)切酶處理的質(zhì)粒pMV361中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV361-pbp39,雙酶切鑒定后送上海生工公司測序。用 Hpa I,Nhe I對經(jīng)PCR擴增獲得的p276基因片段進(jìn)行雙酶切,克隆入經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒pMV361-pbp39中pbp39片段的下游,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV361-pbp39-p276,PCR鑒定后送上海生工公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 布氏桿菌pbp39基因和標(biāo)記p276基因片段的獲得

布氏桿菌pbp39基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,在1200bp處可見明顯的擴增產(chǎn)物條帶,未見非特異擴增條帶,與理論擴增產(chǎn)物長度吻合。測序結(jié)果與GenBank報道的序列進(jìn)行比對堿基序列同源性為99%(圖1)。

p276基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后,在270bp處可見明顯的擴增產(chǎn)物條帶,未見非特異擴增條帶,與理論擴增產(chǎn)物長度吻合 (圖2)。

圖1 pbp39基因的PCR擴增

圖2 p276基因的PCR擴增

2.2 重組子pMV361-pbp39的鑒定

提取PCR鑒定陽性菌質(zhì)粒,用EcoR I、Hpa I進(jìn)行雙酶切,得到4415bp的pMV361和1206bp的pbp39 2個片段,基因片段與設(shè)計大小相符 (圖3)。

2.3 重組質(zhì)粒pMV361-pbp39-p276的PCR鑒定

提取篩選的陽性菌pMV361-pbp39-p276質(zhì)粒,分別用 pbp39、p276基因片段的上下游引物,及 pbp39上游引物和p276下游引物進(jìn)行PCR,擴增得到大小約1200bp、270bp和1500bp的3條帶,大小與目的DNA及復(fù)合DNA片段長度相符。表明pbp39-p276復(fù)合基因已克隆入pMV361載體中 (圖 4)。

圖3 重組子的酶切鑒定

圖4 重組子pMV361-pbp39-p276的PCR擴增鑒定

3 討論

布氏桿菌為兼性胞內(nèi)寄生菌,有光滑和粗糙2種表型,主要通過鼻、咽、口腔感染動物。如其他胞內(nèi)寄生的致病菌,布魯氏菌不僅能逃避巨噬細(xì)胞的殺傷作用,且能在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。宿主只有通過激發(fā)抗原遞呈細(xì)胞分泌IL-12,引起THD細(xì)胞分化為THI細(xì)胞,THI細(xì)胞再分泌IFN-γ來上調(diào)巨噬細(xì)胞的吞噬作用[4],才能激活巨噬細(xì)胞的殺菌功能。同時,CD4+,CD8+T細(xì)胞分泌的IL-2,IFN-γ還能直接殺滅被布氏桿菌感染的巨噬細(xì)胞,達(dá)到保護(hù)宿主的目的[5]。因此在抵抗布氏桿菌的免疫反應(yīng)中,細(xì)胞免疫占主導(dǎo)地位。作為保護(hù)性抗原分子的PBP39胞質(zhì)結(jié)合蛋白,是一種良好的T細(xì)胞抗原,幾乎存在于所有的布氏桿菌基因組中,具有較高的同源性,能保證良好的免疫原性,且PBP39在動物體內(nèi)能誘發(fā)強烈的遲發(fā)性超敏反應(yīng),并產(chǎn)生大量的IFN-γ,因此被公認(rèn)為DNA疫苗的候選分子。

pMV361大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體是在pMV261基礎(chǔ)上構(gòu)建起來的,相對于pMV261,pMV361作為整合型表達(dá)載體將其oriM區(qū)域替換為attachment site(attP)和integrase(int)gene,使得pMV361能在宿主體內(nèi)穩(wěn)定存在[6]。而其表達(dá)宿主牛分枝桿菌弱毒苗 (BCG),在表達(dá)多種外源基因抗原的同時還是一種免疫佐劑,能非特異性的增加機體的免疫應(yīng)答,增強免疫效果。且本身作為廣泛使用的結(jié)核病疫苗,能達(dá)到一苗多防的效果,不僅能同時防止布魯氏菌和結(jié)核病的感染,且能區(qū)分布魯氏菌病的疫苗株與野毒株,逐漸達(dá)到凈化布魯氏菌的目的。

綜上所述,本研究將標(biāo)記p276基因和抗原pbp39基因聯(lián)合重組于pMV361大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒,為下一步構(gòu)建能分泌性表達(dá)pbp39-p276的重組卡介苗基因疫苗,研究其免疫原性和免疫保護(hù)性打下了基礎(chǔ)。

[1]王大力,李鐵鋒,王季秋,等.2009年全國布魯氏菌病監(jiān)測結(jié)果分析 [J].中國地方病防治雜志,2010,25(6):419-421.

[2]滿騰飛,王大力,崔步云,等.2009年全國布魯氏菌病監(jiān)測數(shù)據(jù)分析 [J].疾病監(jiān)測,2010.25(12):944-946.

[3]丁家波,毛開榮,程君生,等.布氏桿菌病疫苗的應(yīng)用和研究現(xiàn)狀[J].微生物學(xué)報,2006,46(5):856-859.

[4]Murphy A,Sathiyaseelan J,Parent M A,et al.Interferongamma is crucial for surviving a Brucella abortus infection in both resistant C57BL/6 and susceptible Balb/c mice[J].Immunology,2001,103:511-518.

[5]曾 政,王 英,趙光宇,等.布氏桿菌pCDNA3.1-L7/L12核酸疫苗的構(gòu)建及免疫學(xué)評價[J].免疫學(xué)雜志,2004,20(3):208-212.

[6]Stover C K,de la Cruz V F,Fuerst T R,et al.New use of BCG for recombinant vaccines[J].Narure,1991,351:456-460.