朱杰 郭連紅 張詩音 王霖 王國棟

(1. 西北農林科技大學 理學院 生物物理研究所 心血管再生研究組，陜西 楊凌712100;2. 吉林大學 超分子結構與材料國家重點實驗室，吉林 長春 130012;3. 西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌712100;4. 中南大學 公共衛(wèi)生學院，湖南 長沙 410078；5. 西北農林科技大學 創(chuàng)新實驗學院，陜西 楊凌712100)

前言

1986年，斯坦福大學的Binnig G等人發(fā)明的原子力顯微鏡 (Atomic Force Microscope, AFM)的放大倍數(shù)}遠遠超過以往的任何顯微鏡[1]。光學顯微鏡(Optical Microscopy, OM)的放大極限僅為103倍，電子顯微鏡(Electronic Microscopy，SEM/TEM)的放大極限也只有106倍，而AFM的放大極限則高達109倍，在觀察生物大分子的結構上具有很大的優(yōu)勢。另外，作為目前生物醫(yī)學超微結構研究最常用的工具，SEM/TEM成像要求對生物樣品進行固定、脫水、包埋、切片、染色或鍍金等一系列繁瑣處理；而AFM 則可在大氣或溶液中直接觀測生物樣品及其動態(tài)變化過程。除此以外，AFM通過控制并檢測針尖--樣品之間的相互作用力，可以分析研究與作用力相應的各種表面性質：采用最新的Tapping技術和Phase技術可以測試樣品的硬度和彈性等力學特性；AFM可對生物大分子進行力學操作?？傮w上，AFM擁有原子級的高分辨率，可以觀察活的生物樣品，能夠對樣品進行力學操縱，這些特性使AFM在生物大分子超微結構與生物力學研究中具有廣泛的應用前景。

1.AFM在生物大分子超微結構研究中的應用

(1)蛋白分子：由于膜蛋白結構的復雜性和研究條件不成熟等因素，以前對膜蛋白結構的認識較少，AFM的出現(xiàn)為膜蛋白結構的認識提供了先進手段。蛋白質分子在脂膜上有規(guī)律地排列甚至形成二維晶體，均適合于用AFM研究[2]。低信噪比的AFM可用來來檢測膜蛋白的原子結構，高信噪比的AFM則可直接對膜蛋白在納米級分辨率清晰成像；特殊信噪比的AFM可使膜蛋白在接近生理狀態(tài)下成像，水平分辨率達到0.5～1nm。垂直分辨率可達0.1～0.2 nm。隨著AFM探針技術的發(fā)展，最近對蛋白的研究已達到可以同時對多種參數(shù)進行計量和測算的程度。游離蛋白不易在載體上被固定，其成像質量往往不及膜蛋白，但AFM還是能夠比較成功地觀察肌動蛋白、血纖維蛋白原、免疫球蛋白等游離蛋白分子。如對肌動蛋白的觀察，早期用AFM獲得的圖像中可看到5 nm高隆起的肌動蛋白分子結構，隨著探針技術的不斷發(fā)展，逐步觀測到了肌動蛋白分子的螺旋構造，現(xiàn)今用輕敲模式不僅觀測到70nm長的D帶區(qū)，就連區(qū)內的亞結構也能觀察。通過AFM對肌動蛋白聚合、解聚、破裂、彈性系數(shù)變化等過程的觀察，證實了肌動蛋白的網絡結構對活細胞穩(wěn)定性的決定作用。

(2)脫氧核糖核酸：自從Lindsay等首次用AFM獲得脫氧核糖核酸的圖像以來，AFM已經成為研究核酸分子結構的重要工具[3]。Bustamante等用AFM在室溫和干燥空氣條件下得到質粒DNA的圖像，可以清晰地觀測到三維環(huán)狀DNA分子的結構，并可估算分子的寬度和高度[4]。Claudio等觀察了在不同的濕度下DNA構型的變化,如A-型、B-構型、Z-構型等[5]。更大的核酸結構如核小體和染色體包括染色體定位、轉錄、轉移和小分子DNA交互作用等同樣可用AFM來研究。Tiner等利用AFM觀察到了三鏈DNA (H-DNA)結構，并得到H-DNA與雙鏈DNA的厚度明顯不同,經過仔細測量發(fā)現(xiàn)H-DNA的結構與現(xiàn)有理論模型符合得很好[6]。Jiao等動態(tài)觀察了p53蛋白和DNA的相互作用，實驗觀察到p53與DNA結合、分開及其在DNA上滑動等現(xiàn)象,甚至發(fā)現(xiàn)了p53與DNA特異的序列結合[7]。Sahin等利用AFM進行了G-顯帶染色體的觀察,發(fā)現(xiàn)在染色體顯帶區(qū)域染色質濃密凝集,而非顯帶區(qū)染色質則松散,而姐妹染色體常在此區(qū)域借助染色體絲來相互聯(lián)系[8]。

(3)多糖：生物學上多糖的復雜性和重要性不言而喻，雖然多糖分子往往帶有支鏈，分子的均一性及線性不如DNA和蛋白質好，但用AFM可以清楚地觀測多糖分子的高級結構與二維網絡結構，并可研究多糖濃度及幾種離子在不同濃度下對凝膠網絡形成的影響。Baldwin等用AFM研究了土豆和小麥淀粉顆粒表面。兩類淀粉具有不同的表面形貌，土豆淀粉粒表面有許多突起部分，直徑在100～300 nm，在相對平坦的面上包含一些10～50 nm的微結構；而小麥淀粉的突起部分相當少，表面較平滑。Baldwin等認為這些突起部分代表淀粉顆粒表面的支鏈淀粉側鏈簇的末端，與“blocklets”結構相對應[9]。而Leslaw等用非接觸式AFM系統(tǒng)地研究了各類淀粉顆粒表面的拓撲形貌，發(fā)現(xiàn)玉米淀粉和木薯淀粉的顆粒表面比馬鈴薯淀粉顆粒表面要平滑，后者的顆粒表面有高達1μm的突起[10]。Andrew利用接觸式AFM觀察到淀粉顆粒內部的納米結構, 發(fā)現(xiàn)玉米淀粉顆粒內部生長環(huán)之間有400～500 nm的阻隔帶。且發(fā)現(xiàn)在制樣過程中由于切割刀的作用將淀粉顆粒生長阻隔帶(block)處拔出90 nm深的坑[11]。McIntire等用非接觸模式AFM觀察了直鏈淀粉的納米結構，發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉分子在水溶液中分散較好，在75個淀粉分子中，平均等高線長為230.7 nm[12]。

2. AFM在生物力學研究中的應用

生物體內幾乎所有的物理化學過程都與生物分子結構中某些特異位置之間的弱鍵作用相關。根據簡單模型得到的生物分子間的作用力需經過理論計算進行推斷, 其結果太理想化因而很難真實反映生物分子的實際狀況，同時也無法動態(tài)反映生物體內的分子運動過程。而利用AFM可實時測量生理狀態(tài)生物分子間的作用力及細胞表面的動態(tài)變化如：細胞間粘著力、化學基團間的作用力、配體受體間的作用、DNA互補鏈和核苷堿基間的氫鍵等，進而綜合研究生理環(huán)境中的各種生物樣品的微觀性質[13]。

(1)細胞間粘著力：細胞的粘著對于多細胞有機體的解剖完整性方面具有重要意義。Dammer等人利用AFM測定了海藻細胞的粘著力。在生理環(huán)境中，粘著細胞間的粘著力可達400pN。一個粘附分子對之間的粘附力可承受1600個細胞的重量。分子間高度的結合力可能正是形成多細胞海藻有機體完整性的基礎[14]。Thie等用AFM研究了人子宮內皮細胞系和人滋養(yǎng)型細胞(JAR)之間的黏附作用。他們將JAR功能性地結合在AFM掃描探針的尖端,然后與單層的子宮內皮細胞層作用不同的時間段。這項研究第一次界定了滋養(yǎng)細胞和子宮內皮細胞間的相互作用[15]。Kim等用光鏡和原子力顯微鏡對鼠成骨細胞間的黏附力作用進行了定性與定量研究，這對于研究多細胞生物體中細胞-細胞間的相互作用是一個非常重要的啟示[13]。

(2)化學基團間作用：生物大分子是由許多相互關聯(lián)的功能團組成，這些功能團間的作用力決定生物大分子的整體屬性。Frisbie等人利用經親水分子功能化的AFM探針，測量了單層有機分子的粘著力和摩擦力，再現(xiàn)了特殊功能基團的二維形貌圖。實驗表明,在簡單的疏水分子--疏水分子、疏水分子--親水分子和親水分子--親水分子間的粘合作用可以多次重復測量。功能基團間粘著作用的方向與預期的結果基本一致，即在親水基團間的相互作用大于疏水基團間的相互作用，從而能夠形成氫鍵；在各種基團的作用力中，相同基團間的相互作用最強，而不同基團間的相互作用最弱；基團間粘附作用大于這些測量中的不確定性，并且可以多次重復測量，因而可以根據測得的粘附力的大小可以判斷這些功能基團[16]。

(3)配體-受體作用： Wong將AFM探針用抗生物素蛋白衍生化,將瓊脂糖的珠粒用生物素、去硫生物素或亞胺生物素功能基化,測定衍生化探針與功能基化瓊脂糖的珠粒之間的作用力。試驗證明生物素類似物與抗生物素單分子間的力是由量子化的力單位組成的。并以類似方式測定了抗生物素--生物素同類物間的作用力，結果顯示不同的抗生物素--生物素分子間的去結合力不同；相應的熱動力學能量研究表明，去結合力與自由能ΔG的變化無關而與焓變ΔH有明確的線性關系，其比例因子由結合勢Reff=ΔHFu給出,其中Fu是去結合力[17]。

(4)DNA互補鏈和核苷堿基間的氫鍵：Lee等人測定了DNA互補鏈間的相互作用力，將DNA寡聚核苷酸共價結合在探針和基底的表面，利用AFM測量了DNA互補鏈之間的作用力；如果有第三個長DNA偶聯(lián)于互補鏈之間，則可以觀察到鏈內和鏈間的作用力。Antoranz等的研究結果表明AFM不僅可以測定特異堿基對之間的相互作用,而且經由原子力顯微鏡測量的這類相互作用能很好地與Watson- Crick模型相符合[18]。Ratner等人的實驗表明核苷堿基對的氫鍵作用具有量子化特征,并指出該量子化單位值恰好為一個堿基對間的作用力；另外，力測量試驗顯示：腺嘌呤--胸腺嘧啶作用曲線上有兩個最低值，一個是氫鍵作用，一個是常規(guī)作用；無論胸腺嘧啶過量與否,常規(guī)作用的曲線相同；但若加入可溶性胸腺嘧啶,氫鍵峰值則減小7倍；從上述試驗事實可知，在溶液中加入過量的胸腺嘧啶可以專門抑制腺嘌呤尖端與胸腺嘧啶表面的相互作用[19]。

3. AFM在生物大分子研究中的應用前景

AFM作為一種顯微探測工具，25年來，已被廣泛地應用于在生物學各領域，與以往的各種顯微工具相對比，AFM以其分辨率高、樣品制備簡便、制樣過程對樣品原始形態(tài)影響小、能在生理條件下進行動態(tài)研究等優(yōu)點備受青睞?；蛟\斷和基因治療已成為提高醫(yī)療水平的熱點，在此人們便需要對生物分子進行分子和原子水平結構和形態(tài)的直接觀察和研究，而AFM正好能夠滿足這種要求。另外，基因組計劃大規(guī)模測序工作已基本完成，人們將視線聚焦到了后基因組即蛋白質組的研究上。而想要了解蛋白質的功能首先要了解其結構，AFM提供了這樣一個平臺。在這個平臺上我們不僅可以觀察蛋白質結構并了解其功能,還可以動態(tài)觀察蛋白間的相互作用以及蛋白質與DNA、RNA間的相互作用，這樣就可以進一步了解蛋白結構域的功能情況，并由此推斷擁有此結構域的蛋白的功能。另外，腫瘤的診斷與治療仍是一大挑戰(zhàn)性課題。AFM可通過對腫瘤細胞的形態(tài)來判斷腫瘤的類型與屬性，從而起到腫瘤診斷作用；作為一種力學操縱手段，AFM可對生物標本進行直接切割、鉆孔、打磨等操作，從而能夠對細胞進行納米級的人工操作，以達到對病理細胞進行“手術”的目的，這樣便有可能對腫瘤進行治療。盡管AFM研究中還存在針尖污染、針尖對樣品的影響等不利因素，但隨著納米管技術的不斷發(fā)展，探針制造工藝的不斷改進及計算機技術的進步[20]，可以預見，AFM必將為大分子生物學的研究帶來突破性進展。

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