郭慶，王忠躍，孔繁芳，武艷霞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

1983年美國PE Cetus公司人類遺傳研究室的Kary Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）[1]，該體外核酸擴(kuò)增技術(shù)具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，成為分子生物學(xué)、鑒別遺傳疾病和快速檢測病毒和病菌感染必不可少的研究工具。1992年日本人Higuchi想實(shí)時(shí)觀察PCR反應(yīng)的全過程，最終達(dá)到檢測樣品中的DNA量的目的，最早提出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的設(shè)想[2,3]，繼而由1996年美國Applied Biosystems公司首先推出實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)都是依賴于產(chǎn)物的終點(diǎn)濃度進(jìn)行分析的，存在不能準(zhǔn)確定量，且操作過程中易污染而使得假陽性率高等缺點(diǎn)，使其應(yīng)用受到局限，直到近年來熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）技術(shù)用于PCR定量后，上述問題才得到較好的解決[4]，隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR的發(fā)明，此技術(shù)在不同研究領(lǐng)域都發(fā)揮出重要作用[5～8]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上把熒光共振能量轉(zhuǎn)移與熒光標(biāo)記探針相結(jié)合，并巧妙地把核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測技術(shù)融合在一起的一項(xiàng)創(chuàng)造性技術(shù)，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA模板的定量，它具有實(shí)時(shí)性、快速、靈敏、高通量、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確定量等特點(diǎn)。

近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)不斷完善，取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。由于該技術(shù)本身的優(yōu)越性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療檢測、藥物療效考核、基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究、基因檢測、病原體檢測、動(dòng)植物檢測、食品安全等不同研究領(lǐng)域[9,10]。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)成為分子生物學(xué)研究中的重要工具[11～12]，而在植物害蟲研究上的報(bào)道相對(duì)其他領(lǐng)域較少，但是隨著最近幾年實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，有力地促進(jìn)了植物害蟲研究水平的提高，而且發(fā)揮著越來越重要的作用，已經(jīng)顯示出了極好的應(yīng)用前景。

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR概述

1.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理的基礎(chǔ)是熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理（fluorescence resonance energy transfer, FRET），是指當(dāng)一個(gè)熒光分子（供體分子）的發(fā)射光譜與另一個(gè)熒光分子（受體分子）的吸收光譜相重疊時(shí)，且兩個(gè)集團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長波長（低能量）的熒光基團(tuán)，相當(dāng)于短波長熒光集團(tuán)釋放的熒光被屏蔽，這個(gè)過程稱為FRET。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)的強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線，利用熒光信號(hào)積累強(qiáng)度的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，最后在這一階段通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中有兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和Ct值。熒光閾值是指在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)，一般這個(gè)閾值是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光基礎(chǔ)信號(hào)，熒光閾值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差10倍，如果檢測到的熒光信號(hào)超過閾值才被認(rèn)為是可信的信號(hào)。而在PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)被稱為Ct值，C代表循環(huán)（Cycle），T代表閾值（Threshold）[10]。對(duì)于Ct值與起始模板量關(guān)系的研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到該樣品的起始拷貝數(shù)[11]。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特點(diǎn)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR與傳統(tǒng)PCR相比，它具有諸多優(yōu)點(diǎn)：⑴ 定量原理獨(dú)特，用產(chǎn)生熒光信號(hào)的多少來顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)連續(xù)熒光監(jiān)測，可視性強(qiáng)；⑵ 不需要PCR反應(yīng)后的處理，而且只須在加樣時(shí)打開一次蓋子，大大降低了污染的可能性；⑶ 可以在很大濃度范圍內(nèi)(>10倍）進(jìn)行定量，有較高的靈敏度、特異性和精確性；⑷ 既可以做定性分析又可以做定量分析[13～14]。同時(shí)該技術(shù)也與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比還有其不足之處：⑴ 由于減少了擴(kuò)增后電泳的檢測步驟，因此不能監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。⑵ 在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中，由于沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各實(shí)驗(yàn)室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)樣品各不相同，致使試驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性；⑶ 試驗(yàn)成本太高，也限制了其的應(yīng)用范圍；⑷ 由于該技術(shù)極其靈敏，所以對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的精確度要求較高。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類

根據(jù)熒光基團(tuán)標(biāo)記和實(shí)現(xiàn)能量共振轉(zhuǎn)移方式的不同，目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用比較廣泛的為四大類，分別是熒光染料（SYBR Green）、水解探針（Tapman）、雜交探針、分子信標(biāo)，除此以外還有熒光標(biāo)記引物，復(fù)合探針法，Lighf-uP、Cyclicons、LUXt、Scorpion、Amplifluor等[15～17]。

2.1 熒光染料（SYBR Green）

SYBR Green是一種能與dsDNA特異結(jié)合的染料，在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR Green，SYBR Green特異地與dsDNA結(jié)合，發(fā)出熒光信號(hào)[18]。DNA結(jié)合染色的方法不需要使用特異性熒光標(biāo)記的探針，相對(duì)簡便，同時(shí)也降低了檢測的成本，其特異性完全由PCR的引物所決定。其主要不足是：染料與DNA雙鏈分子的結(jié)合是非特異性的，它可以和反應(yīng)體系中所有DNA分子結(jié)合，易受到非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的影響，產(chǎn)生熒光干擾，實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽性信號(hào)，使定量結(jié)果不可靠。不過目前可以用熔解曲線分析來區(qū)分特異性和非特異性擴(kuò)增，引物的設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的優(yōu)化對(duì)消除非特異性熒光也有很大幫助。

2.2 水解探針（Tapman）

目前在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中應(yīng)用較多的水解探針是Tapman探針。探針5’端標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，3’端一個(gè)淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），所以檢測不到該探針5’端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。在PCR擴(kuò)增過程中，由于Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針的熒光基團(tuán)切下，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，不能發(fā)生FRET而產(chǎn)生熒光信號(hào)，每擴(kuò)增一條DNA鏈就有一個(gè)游離的熒光分子形成，可通過檢測系統(tǒng)觀察到信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。利用標(biāo)準(zhǔn)品模板系列繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合各樣品的Ct值，可確定樣品的起初模板量[19]。美國ABI公司推出另外一種水解探針為Tapman-MGB探針，它與Taqman探針相比能更好地穩(wěn)定探針與模板的雜交，升高探針Tm值[20]，使較短的探針同樣能達(dá)到較高的Tm值，簡化了探針的設(shè)計(jì)，更有益檢測單堿基突變。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是由于其長度短于Taqman探針，熒光和淬滅基團(tuán)的距離更近，淬滅效果更好，而使熒光背景更低。

2.3 雜交探針（Hybridization probe）

雜交探針技術(shù)主要是使用兩個(gè)特異的探針，其中上游的探針的3’端標(biāo)記供體熒光基團(tuán)，而下游的探針的5’端標(biāo)記有受體熒光基團(tuán)。在PCR模板退火階段，兩探針同時(shí)與目的基因發(fā)生頭尾結(jié)合形式的特異性結(jié)合，使供體和受體熒光基團(tuán)距離非常接近，兩者產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使得受體熒光基團(tuán)發(fā)出熒光，當(dāng)兩探針處于游離狀態(tài)時(shí)，無熒光產(chǎn)生。由于反應(yīng)中運(yùn)用了兩個(gè)探針，因此增加了方法的特異性，但兩個(gè)探針結(jié)合于模板上影響擴(kuò)增效率。

2.4 分子信標(biāo)（Molecular beacons）

分子信標(biāo)技術(shù)是在同一探針的兩末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，為一種標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針。在未與模板發(fā)生雜交前該探針分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，結(jié)合在其兩端的熒光基團(tuán)距離上接近，產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，不發(fā)生熒光。當(dāng)該探針與模板雜交，使熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團(tuán)脫離了淬滅基團(tuán)的影響，從而產(chǎn)生可被檢測到的熒光。熒光的強(qiáng)度與溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR定量分析[21]，若目標(biāo)DNA序列同分子信標(biāo)不能完全配對(duì)，雜交過程和信號(hào)不會(huì)出現(xiàn)。若在發(fā)夾結(jié)構(gòu)中熒光標(biāo)記物不能緊靠淬滅基團(tuán)，會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的背景信號(hào)。若分子信標(biāo)內(nèi)雜交過強(qiáng)，會(huì)妨礙同目標(biāo)DNA分子的雜交，使得熒光信號(hào)不能充分釋放。最佳的分子信標(biāo)應(yīng)有合適的熔鏈特性。分子信標(biāo)可檢測單個(gè)核苷酸的突變，適于SNP分析和等位基因突變分析。但設(shè)計(jì)較難，既要避免產(chǎn)生強(qiáng)的背景信號(hào)，又要避免莖部雜交過強(qiáng)，影響其與模板退火，從而影響熒光生成。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，有兩種定量模板的方法：絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量指用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知的樣本量；相對(duì)定量指在一定樣品中靶序列相對(duì)于另一參照序列的量的變化[22]。

3.1 相對(duì)定量

相對(duì)定量指的是在一定樣本中靶序列相對(duì)于另一參照樣本的量的變化。此方法與絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線法基本相似，不同之處是未知樣品的量是相對(duì)于某個(gè)參照物的量而言。因此，相對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較容易制備，對(duì)于所用的標(biāo)準(zhǔn)品只需知道其稀釋度即可。

3.2 絕對(duì)定量

絕對(duì)定量指的是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知的樣本的量。此方法標(biāo)準(zhǔn)品的量是預(yù)先已知的。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度的樣品，并作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測得的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)未知樣品進(jìn)行定量時(shí)，根據(jù)未知樣品的Ct值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)錄的RNA常作為絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品。

3.3 比較Ct法的相對(duì)定量

即△Ct值法，此方法是同時(shí)擴(kuò)增待測靶基因片段和一個(gè)作為內(nèi)參照的基因片段，一般是一個(gè)內(nèi)源性管家基因片段。通過測兩者的Ct值之差（△Ct），比較不同待測標(biāo)本DNA的△Ct值與正常標(biāo)本DNA的△Ct值的變化，可對(duì)未知標(biāo)本靶基因的原始拷貝數(shù)作出判斷。

4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在植物害蟲方面的應(yīng)用

目前，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)應(yīng)用于植物害蟲鑒定、防治等研究相對(duì)其他領(lǐng)域較少，但該技術(shù)在植物害蟲、植物病原線蟲和害螨研究中已經(jīng)顯示出了極好的應(yīng)用前景。

4.1 在植物害蟲鑒定及檢測研究中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的植物害蟲鑒定方法依賴于形態(tài)特征和寄主范圍等特征來區(qū)分，但是對(duì)于一些植物害蟲之間的區(qū)分比較困難，尤其是檢疫性植物害蟲實(shí)蠅類，薊馬類等，而實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是解決這一問題的可靠手段。余道堅(jiān)[23]應(yīng)用TaqMan探針和SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，分別建立了兩種快速鑒定重要檢疫性害蟲辣椒實(shí)蠅（Bactrocera latifrons）的方法。同時(shí)余道堅(jiān)等[24]還應(yīng)用SYBR Green實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)，分別建立了SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR快速鑒定菲立濱實(shí)蠅（bactrocera philippinensis）和芒果實(shí)蠅（bactrocera occiptalis）的方法。實(shí)現(xiàn)了對(duì)檢疫性實(shí)蠅快速準(zhǔn)確的鑒定。徐浪等[25]應(yīng)用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)形態(tài)學(xué)方法很難鑒別的大洋臀紋粉蚧（Planococcus minor）和南洋臀紋粉蚧（Planococcus lilaciu）進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，從而達(dá)到快速鑒定檢疫性粉蚧的目的。K.Walsh等[26]利用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立了快速鑒定重要檢疫性害蟲南黃薊馬（Thrips palmi）的方法。K.S.Huang等[27]也應(yīng)用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)建立了快速鑒定重要檢疫性害蟲西花薊馬（Frankliniella occidentalis）的方法。

另外，實(shí)時(shí)定量PCR還可以用來檢測土壤中的害蟲。KAREN HERBERT等[28]利用TaqMan熒光定量PCR技術(shù)，結(jié)合土壤DNA的提取，對(duì)土壤中葡萄根瘤蚜（Daktulosphaira vitifoliae）若蟲進(jìn)行了檢測，表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR在檢測土壤中植物害蟲和監(jiān)測種群動(dòng)態(tài)變化方面具有很好的前景。

4.2 在植物害蟲生理研究中的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在植物害蟲生理研究中也有很好應(yīng)用前景。崔旭紅等[29]利用TaqMan-MGB探針和特異性引物構(gòu)建了B型煙粉虱（Bemisia tabaci）hsp70實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測體系，對(duì)HSP70在B型煙粉虱抵抗高溫脅迫中的作用進(jìn)行研究。翟會(huì)芳等[30]也構(gòu)建了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR體系，研究了HSP90在甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）幼蟲抗高溫中的作用。證明了該技術(shù)是研究植物害蟲抗逆性和相關(guān)基因表達(dá)的理想工具。Kanako Komaki等[31]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和熒光測定法對(duì)各蟲態(tài)豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）細(xì)胞內(nèi)共生細(xì)菌（Buchnera）的基因拷貝數(shù)進(jìn)行了研究，證明了該技術(shù)是研究植物害蟲體內(nèi)共生菌變化的靈敏工具。

4.3 在植物害蟲防治研究中的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR植物害蟲防治研究中也有出色的表現(xiàn)。Lei等[32]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)酚氧化酶原-2（PxPPO2）在小菜蛾（Plutella xylostella）不同蟲態(tài)中的轉(zhuǎn)錄量進(jìn)行研究，可以通過降低PxPPO2的轉(zhuǎn)錄水平開發(fā)新型性殺蟲劑。張清平等[33]利用基于綠僵菌rDNA基因片段設(shè)計(jì)的PCR引物對(duì)、優(yōu)化的DNA制備方法以及熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)早期東亞飛蝗（Locusta migratoria manilensis）體內(nèi)的病原真菌DNA進(jìn)行簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測，并確定病原真菌在其內(nèi)的增殖速率和動(dòng)態(tài)變化。楊和平等[34]利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了甜菜夜蛾病毒殺蟲劑中甜菜夜蛾核型多角體病毒有效含量。證明了熒光定量PCR技術(shù)可以用于殺蟲劑有效生物含量的測定。James A.Anstead等[35]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)建立了準(zhǔn)確檢測導(dǎo)致桃蚜（Myzus persicae）對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的兩個(gè)基因突變位點(diǎn)L1014F（kdr）和 M918T（super-kdr）。Y.P.Chen等[36]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)舞毒蛾（Lymantria dispar）被刻絨繭蜂（Glyptapanteles indiensis）寄生后不同時(shí)期不同組織中的GiPDV 1.1的表達(dá)量進(jìn)行檢測，證明該方法是一種可用于基因表達(dá)分析很好的工具。

4.4 在植物病原線蟲和螨類研究中的應(yīng)用

近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)也開始的應(yīng)用于植物病原線蟲和害螨的研究，并獲得很好的研究成果。王焱等[37]分別用特異性引物法、ITS-PCR-RFLP法和實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)松材線蟲進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明實(shí)時(shí)熒光PCR法耗時(shí)短，靈敏度高，適合用于松材線蟲的檢驗(yàn)檢疫。國內(nèi)外多篇文獻(xiàn)均有報(bào)道了應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，不僅能快速、準(zhǔn)確的對(duì)松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）進(jìn)行鑒定，也能夠?qū)€蟲進(jìn)行定性和定量分析[38～41]。王明旭等[42]利用松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）和擬松材線蟲（B．mucronatus）的rDNA-ITS2種間差異顯著特性，設(shè)計(jì)TaqMan探針，用實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測方法能準(zhǔn)確地區(qū)別2種線蟲。Berry等[43]建立了爪哇根結(jié)線蟲（Meloidogyne javanica），玉米根腐線蟲（Pratylenchus zeae）和桑大型針線蟲（Xiphinema elongatum）的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測方法，對(duì)寄生甘蔗的三種線蟲實(shí)現(xiàn)了靈敏，準(zhǔn)確的檢測和定量。王翀等[44]設(shè)計(jì)鱗球莖莖線蟲（Ditylenchus dipsaci）特異的TaqMan 探針，建立了實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測方法。賀俊飛等[45]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測中華卵索線蟲（Ovomermis sinensis）體內(nèi)tra-1基因表達(dá)量，研究tra-1基因在中華卵索線蟲雌性生殖系統(tǒng)的發(fā)育、卵的形成以及胚胎的發(fā)育中的調(diào)控作用。Madani等[46]利用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量，對(duì)馬鈴薯胞囊線蟲（Globodera pallida）以及甜菜胞囊線蟲（Heterodera schachtii）進(jìn)行檢測和定量。Zhang等[47]利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR定量檢測潛在植物寄生線蟲生防菌-洛斯里被毛孢子的種群密度，研究食線蟲真菌的DNA量和被寄生線蟲的百分比之間的關(guān)系，并可結(jié)合生物測定監(jiān)測土壤真菌的生物量和活性效果。李明等[48]運(yùn)用real-time PCR分析冷激和熱激后HSP70基因TCHSP70-4在朱砂葉螨體內(nèi)的表達(dá)量，對(duì)朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus（Boisduval））熱激蛋白HSP70的表達(dá)與其適應(yīng)高溫和低溫脅迫的關(guān)系進(jìn)行了研究。

5 小結(jié)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新的檢測方法，與常規(guī)RT-PCR相比具有明顯優(yōu)越的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和操作簡便的特點(diǎn)，但仍有些問題需解決，如自動(dòng)化儀器﹑試劑及其檢測的成本等。近些年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)還廣泛應(yīng)用于植物營養(yǎng)學(xué)研究、植物發(fā)育學(xué)研究、植物抗逆機(jī)理研究、轉(zhuǎn)基因植物的檢測、植物與微生物互作機(jī)理研究、植物抗病性檢測、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境對(duì)植物基因表達(dá)的影響等方面[49]。在植物病蟲害研究的許多領(lǐng)域顯現(xiàn)出它的優(yōu)越性，并開始被廣泛應(yīng)用。

許多科研工作者基于熒光PCR的基本原理對(duì)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行不斷深入的研究和改進(jìn)，使熒光PCR技術(shù)得到了進(jìn)一步的完善，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出了許多新的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)與生物基因芯片技術(shù)結(jié)合會(huì)使FQ-PCR技術(shù)進(jìn)一步完善，可提高其在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍和普及程度，F(xiàn)Q-PCR將成為未來植物害蟲研究的必備工具，在植物保護(hù)領(lǐng)域?qū)⒌玫礁訌V泛的應(yīng)用。

[1]Mullis K, Faloona F, Scharf S, et a1.Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction [J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1986,51(Pt1): 263-273.

[2]施林祥, 李東輝.實(shí)時(shí)熒光PCR研究新進(jìn)展[J].WORLD CHINESE JOURNAL OF DIGESTOLOG, 2005, 13(5):596-599.

[3]Higuchi R, Dollinger G, Walsh P S, et al.Simultaneous Amplification and Detection of Specific DNA Sequences[J].Bio-Technology, 1992, 10(4): 413-417.

[4]Clegg R M.Fluorescence resonance energy transfer[J].Current Opinion in Biotechnology, 1995, 6 (1): 103-110.

[5]Guan H, Yang K.RNA isolation and real-time quantitative RT-PCR[J].Methods Mol Biol, 2008, 456: 259-270.

[6]Zimmermann K, Mannhalter J W.Technical aspects of quantitative competitive PCR[J].Biotechniques, 1996,21(2): 268-279.

[7]Freeman W M, Walker S J, Vrana K E.Quantitative RT-PCR:Pitfalls and Potential[J].Biotechniques, 1999, 26(1):112-125.

[8]Arya M, Shergill I S, Williamson M, et al.Basic principles of real-time quantitative PCR [J].Expert Rev Mol Diagn,2005, 5(2): 209-219.

[9]Levin R E.The application of real-time PCR to food and agricultural systems[J].A Review Food Biotechnology,2004, 18(1): 97-133.

[10]趙煥英, 包金風(fēng).實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志, 2007,16(4): 492-497.

[11]Mikael K, Jose M A, Martin B, et al.The real-time polymerase chain reaction[J].Molecular Aspects of Medicine, 2006, 27(2-3): 95-125.

[12]Dieter Klein.Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations[J].TRENDS in Molecular Medicine, 2002, 8(6): 257-260.

[13]Bustin S A, Bences V, Nolan T, et a1.Quantitative real-time RT-PCR-a perspective[J].Journal of Molecular Endocrinology, 2005, 34:597-601.

[14]Ginzinger D G.Gene quantification using real-time quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream[J].Exp Hematol.2002, 30(6): 503-512.

[15]Isacsson J, Cao H, Ohlsson L, et a1.Rapid and specific detection of PCR products using light-up probes[J].Molecular Cell Protein, 2000, 14: 321-328.

[16]Svanvik N, Stahlberg A, Sehlstedt U, et a1.Detection of PCR products in real time using Light-up probes[J].Analytical Biochemistry, 2000, 287: 179-l82.

[17]Kandimalla E R, Agrawal S.‘Cyclicons’ as hybridization-based fluorescent primer-probes: synthesis,properties and application in real-time PCR[J].Bioorg Med Chem.2000, 8: 1911-1916.

[18]Agindotan B O, Shiel P J, Berger P H.Simultaneous detection of potato viruses, PLRV, PVA, PVX and PVY from dormant potato tubers by TaqMan ? real-time RT-PCR[J].Virol Methods, 2007, 142: 1-9.

[19]Livak K J, Flood S J, Marmaro J, et al.Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization[J].PCR Methods Appl, 1995, 4(6): 357-362.

[20]Uchiyama M, Maesawa C, Yashima-Abo A, et al.Consensus JH gene probes with conjugated 3’-minor groove binder for monitoring minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia[J].J Mol Diagn, 2005, 7(1):121-126.

[21]Tyagi S, Kramer F R.Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization[J].Nature Biotechnology,1996, 14(3):303-308.

[22]Wang S Q, Wang X H, Chen S H, et a1.A new fluorescent quantitative polymerase chain reaction technique[J].Analytical Biochemistry, 2002, 309: 206-211.

[23]余道堅(jiān), 章桂明, 陳志粦, 等.SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光PCR快速鑒定辣椒實(shí)蠅[J].植物檢疫, 2006, 20(1):10-14.

[24]Yu D J,Chen ZL, Zhang R, et a1.real-time qualitative PCR for the inspection and identification ofbactrocera philippinensisandbactrocera occiptalis(DIPTERA:TEPHRITIDAE) using SYBR GREEN assay[J].RAFFLES BULLETIN OF ZOOLOGY, 2005, 53(1):73-78.

[25]徐浪, 余道堅(jiān), 焦懿, 等.大洋臀紋粉蚧和南洋臀紋粉蚧TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法[J].植物檢疫, 2010,24(2): 24-28.

[26]Walsh K, Boonham N, Barker I, et a1.Development of a sequence-specific real-time PCR to the melon thripsThrips palmi(Thysan., Thripidae) [J].Journal of Applied Entomology, 2005.129(5): 272-279.

[27]Huang K S, Lee S E, Yeh Y, et a1.Taqman real-time quantitative PCR for identification of western flower thrip(Frankliniella occidentalis) for plant quarantine[J].Biology letters, 2010, 6(4): 555-557.

[28]Herbert K, Powell K, Mckay A, et a1.Developing and Testing a Diagnostic Probe for Grape Phylloxera Applicable to Soil Samples[J].Economic Entomology,2008, 101(6): 1934-1943.

[29]崔旭紅, 謝明, 萬方浩.高溫脅迫下B型煙粉虱熱激蛋白基因hsp70表達(dá)量的變化[J].昆蟲學(xué)報(bào), 2007,50(11):1087-1091.

[30]翟會(huì)芳, 江幸福, 羅禮智, 等.甜菜夜蛾HSP90基因克隆及高溫脅迫下其表達(dá)量的變化[J].昆蟲學(xué)報(bào), 2010,53(1): 20-28.

[31]Komaki K, Ishikawa H.Genomic copy number of intracellular bacterial symbionts of aphids varies in response to developmental stage and morph of their host[J].Insect Biochem Mol Biol.2000, 30(3): 253-258.

[32]Lei Du, Bin Li, Li Gao, et a1.Molecular characterization of the cDNA encoding prophenoloxidase-2 (PPO2) and its expression in diamondback mothPlutella xylostella[J].Pesticide Biochemistry and Physiology, 2010, 98(2):158-167.

[33]張清平, 彭國雄, 王中康, 等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測感病蝗蟲體內(nèi)綠僵菌rDNA基因[J].中國生物工程雜志,2005, 25(11): 71-75.

[34]楊和平, 孟小林, 徐進(jìn)平, 等.熒光定量PCR技術(shù)檢測樣品中SeMNPV有效含量[J].中國病毒學(xué), 2006, 21(5):494-498.

[35]Anstead J A, Williamson M S, Eleftherianos I, et a1.High-throughput detection of knockdown resistance inMyzus persicaeusing allelic discriminating quantitative PCR[J].Insect Biochem Mol Biol.2004, 34(8): 871-877.

[36]Chen Y P, Higgins J A, Gundersen-Rindal D E.Quantitation of aGlyptapanteles indiensispolydnavirus gene expressed in parasitized host,Lymantria dispar, by real-time quantitative RT-PCR[J].Virol Methods, 2003,114(2): 125-133.

[37]王焱, 季鐳, 余本淵, 等.3種松材線蟲分子檢測技術(shù)的比較分析[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007,31(4): 128-130.

[38]王金成, 季鐳, 楊秀麗, 等.松材線蟲TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR診斷[J].植物病理學(xué)報(bào), 2006, 36(3): 281-284.

[39]葛建軍, 曹愛新, 劉先寶, 等.應(yīng)用TaqMan-MGB探針進(jìn)行松材線蟲的實(shí)時(shí)熒光定量檢測技術(shù)研究[J].植物病理學(xué)報(bào), 2005, 35(6): 52-58.

[40]Leal I, Green M, Allen E, et a1.Application of a real-time PCR method for the detection of pine wood nematode,Bursaphelenchus xylophilus, in wood samples from lodgepole pine[J].Nematology, 2007, 9(3):51-62.

[41]Cao A X, Liu X Z, Zhu S F, et a1.Detection of the Pinewood Nematode,Bursaphelenchus xylophilus, Using a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay[J].PHYTOPATHOLOGY, 2005, 95(5): 566-571.

[42]王明旭, 朱水芳, 羅寬, 等.松材線蟲rDNA-ITS2的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測[J].林業(yè)科學(xué), 2005,41(2): 82-85.

[43]Berry S D, Fargette M, Spaull V W, et a1.Detection and quantification of root-knot nematode (Meloidogyne javanica), lesion nematode (Pratylenchus zeae) and dagger nematode (Xiphinema elongatum) parasites of sugarcane using real-time PCR[J].Molecular and Cellular Probes, 2008, 22: 168-176.

[44]王翀, 葛建軍, 陳長發(fā).鱗球莖莖線蟲實(shí)時(shí)熒光PCR檢測技術(shù)的研究[J].植物檢疫, 2005, 19(1): 11-14.

[45]賀俊飛, 王偉娜, 周青春, 等.中華卵索線蟲tra-1基因cDNA片段的克隆及實(shí)時(shí)定量表達(dá)分析[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2009, 36(4): 324-328.

[46]Madani M, Subbotin S A, Maurice Moens.Quantitative detection of the potato cyst nematode,Globodera pallida,and the beet cyst nematode,Heterodera schachtii, using Real-Time PCR with SYBR green I dye[J].Molecular and Cellular Probes, 2005, 19: 81-86.

[47]Limei Zhang, Xingzhong Liu, Shuifang Zhu.Detection of the nematophagous fungusHirsutella rhossiliensisin soil by real-time PCR and parasitism bioassay[J].Biological Control, 2006, 36: 316-323.

[48]李明, 盧文才, 馮宏祖, 等.朱砂葉螨熱激蛋白HSP70基因TCHSP70-4的克隆與表達(dá)[J].昆蟲學(xué)報(bào), 2008,51(12): 1235-1243.

[49]胡丹丹, 顧金剛, 姜瑞波, 等.定量RT-PCR及其在植物學(xué)研究中的應(yīng)用[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2007, 13(3):520-525.

致謝：承蒙中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所馮潔研究員審閱、修改本文。