鄧 婕,許巧巧,丁細(xì)桃,龐玲霞

(1溫州醫(yī)學(xué)院,浙江溫州 325035;2溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

HPV檢測倍受人們重視,但大多為原位雜交或PCR法對新鮮組織或脫落細(xì)胞中特定HPV亞型的檢測,而應(yīng)用基因芯片技術(shù)對石蠟包埋組織中的HPV分型檢測鮮見報(bào)道。2008年 8月 ～2010年 9月,我們采用基因芯片技術(shù)對 78例經(jīng)病理證實(shí)的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)組織進(jìn)行HPV分型檢測,并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究78例宮頸CIN(Ⅰ級28例、Ⅱ級25例、Ⅲ級25例)組織均來溫州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科 200～2009年經(jīng)病理證實(shí)的存檔病例,均行HE染色復(fù)查篩選?；颊呔鶠闇刂菔腥?年齡22～72歲,取材前均未行放療和化療。

1.2 HPV檢測及分型方法 將標(biāo)本4μm切片5片,置EP管底,加入裂解液100μl;100℃水浴10 min后立即13 000 r/min離心10 min,取中層DNA溶液5μl加入含有通用引物的20μl PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件:50℃15 min,95℃10 min,94℃30 s,42℃90 s,72℃30 s,40個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min。將固定了 23種探針的膜條標(biāo)記后與PCR產(chǎn)物一起放入6 ml雜交液A(2×SSC, 0.1%SDS)中,100℃變性10min后置于51℃雜交箱進(jìn)行雜交至少1.5 h,雜交后將膜條置 51℃預(yù)溫的洗滌液B(0.5×SSC,0.1%SDS)漂洗5 min,再用POD酶溶液(1︰2 000)于室溫輕振搖30min,A液搖洗2×5 min,C溶液(0.1 M檸檬酸鈉)洗滌1～2 min,放入新配的顯色液中顯色10～30 min后肉眼判讀結(jié)果。陽性對照為HPV35陽性病例,空白對照以蒸餾水取代DNA提取液,檢測的HPV亞型包括18種高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4)和 5種低危型(HPV6、11、42、43、44),受檢樣本的陽性在對應(yīng)的HPV亞型探針位點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)色圓點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。率的比較采用 χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIN中HPV感染率 本組患者中HPV陽性53例(67.9%),其中CINⅠ～Ⅲ中分別為13例(46.4%)、16例(64.0%)、24例(96.0%)。HPV陽性率隨著CIN級別升高而增加,CINⅠ與CINⅡ比較,P＞0.05;CINⅢ與CINⅠ、CINⅡ比較,P均＜0.05。

2.2 CIN中HPV高、低危亞型的分布 本組除CINⅠ中存在2例單純HPV低危亞型感染,CINⅡ和CINⅢ中各有1例HPV高、低危亞型復(fù)合感染外,其余均為HPV高危亞型單一或者多重感染。

2.3 CIN中HPV亞型頻度分布 本組共檢出了13種HPV亞型(HPV 6、11、16、18、31、33、45、51、52、56、58、59、66)。在各級別CIN中,HPV 16、58感染率最高,其中HPV16在CINⅠ～Ⅲ級中的感染率依次為14.3%(4/28)、20%(5/25)、52.0%(13/ 25),HPV58分別為10.7%(3/28)、12.0%(3/25)、 28%(7/25)。CINⅠ中感染的HPV亞型依次為HPV16(4/28)、HPV58(3/28)、HPV52(2/28)、HPV66(1/28)、HPV6(1/28)、HPV11(1/25),CINⅡ中為HPV16(5/25)、HPV58(3/25)、HPV18(3/ 25)、HPV52(2/25)、HPV 33(1/25)、HPV51(1/ 25),CINⅢ中為HPV16(13/25)、HPV 58(7/25)、HPV33(4/25)、HPV18(2/25)、HPV31(2/25)、HPV52(1/25)。

2.4 CIN中HPV單一感染和多重感染 在HPV陽性的53例中,單一感染44例(83.0%),雙重感染8例(15.1%),三重感染(HPV 16,33,59)1例(1.9%)。其中在 CINⅠ中單一感染 12例(92.3%),未見雙重感染,三重感染1例(7.7%); CINⅡ中單一感染15例(93.8%),雙重感染1例(6.2%),未見三重或以上多重感染;CINⅢ中單一感染17例(70.8%),雙重感染7例(29.2%),未見三重或以上多重感染。所檢出的13種 HPV亞型中,除HPV31只見雙重感染外,其他亞型均存在單一感染。

3 討論

目前,宮頸癌一般認(rèn)為是從CIN逐步發(fā)展而來的,在這個(gè)過程中,高危型HPV持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的必要條件。本研究顯示,CIN患者存在極高的HPV感染率,且隨病變級別上升HPV感染率呈明顯升高趨勢,與 Liu等[1]的研究結(jié)果相似。這表明HPV感染是宮頸CIN逐步發(fā)展的必要因素,在低度病變(CINⅠ)中,部分患者存在HPV感染,當(dāng)機(jī)體免疫清除不利時(shí),HPV病毒得以持續(xù)感染,從而與宿主腫瘤細(xì)胞相整合,分別與細(xì)胞內(nèi)腫瘤抑制物p53、pRb結(jié)合使腫瘤抑制物失活。這樣宿主細(xì)胞中原癌基因與腫瘤抑制基因發(fā)生突變的可能性大大增加,從而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[2～4]。在 CINⅢ中HPV感染率明顯高于CINⅠ、CINⅡ,這也證實(shí)了HPV持續(xù)感染是CIN逐步向前發(fā)展的危險(xiǎn)因素之一。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在CIN中幾乎是高危型HPV單一感染或多重感染,僅CINⅠ中有2例為單純低危型HPV感染,這表明高度病變(CINⅡ、CINⅢ)主要是由高危型HPV持續(xù)感染所致。但在宮頸CINⅠ中也出現(xiàn)了高危型 HPV感染為主,與現(xiàn)有報(bào)道[5,6]不完全一致。其原因可能有以下兩點(diǎn):①我們所選的該組病例數(shù)過少,不一定能作為整體的代表;②提示CINⅠ感染HPV高危亞型者具有更進(jìn)一步往高級別CIN,甚至宮頸浸潤癌發(fā)展的可能,其預(yù)后可能較差。因此,應(yīng)該對該部分患者應(yīng)進(jìn)行密切隨訪和定期復(fù)查。

目前,學(xué)者們對HPV單一感染和多重感染與宮頸疾病之間的關(guān)系持不同觀點(diǎn)。陶萍萍等[7,8]認(rèn)為,HPV多重感染與宮頸病變呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,在各級別 CIN中均多以單一感染占優(yōu)勢,多重感染在CINⅠ和CINⅡ中的比率未見明顯差異,而在CINⅢ多重感染的比率明顯高于CINⅠ和CINⅡ。多重感染提示機(jī)體免疫機(jī)制清除病毒不利,是病毒持續(xù)感染的危險(xiǎn)因素,從而導(dǎo)致病情的進(jìn)展,最終發(fā)展為高級別 CIN甚至宮頸癌[9～11]。

綜上所述,應(yīng)用基因芯片技術(shù)對HPV進(jìn)行分型檢測,根據(jù)感染的亞型預(yù)測CIN發(fā)展的可能,有利于為 CIN患者制定合理的治療方案,有利于評估CIN的手術(shù)效果和藥物療效,還能夠針對性的指導(dǎo)HPV預(yù)防疫苗和診斷疫苗的開發(fā),最終有效降低宮頸癌的發(fā)生率和病死率。

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