李普陽,夏學(xué)?。?李 勇,張 偉

(1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西桂林 541001;2桂林醫(yī)學(xué)院)

研究發(fā)現(xiàn)[1],在帕金森病(PD)患者的黑質(zhì)中存在泛素—蛋白酶體途徑(UPP)的功能異常,這可能是PD發(fā)病的核心機(jī)制。Parkin、DJ-1等作為泛素蛋白的配體,對細(xì)胞可起到保護(hù)作用。2008年 9月 ～2010年 5月,我們應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了人Parkin基因重組質(zhì)粒,旨在為PD的基因治療用于臨床奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 總RNA抽提試劑Trizo1,RT-PCR試劑盒。引物由上海生工公司合成,上游為(Cla I)5′-CCATCGATCCACCTACCCAGTGACCA-3′,下游為(Xba I)5′-GCTCTAGACCCATACAGATACATGGATTGCA-3′;克隆載體pUCm-T,菌株DH5α;限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶。

1.2 方法

1.2.1 胎兒黑質(zhì)組織的獲取及其總RNA的提取從 18周自然流產(chǎn)男性胎兒提取黑質(zhì)組織(由臨床醫(yī)院捐贈,并經(jīng)家屬簽署知情同意書),研缽中加入液氮研磨組織塊;取50～100mg,加入1 ml Trizol勻漿,冰上靜置5min。加入200μl氯仿,震蕩15 s,靜置2 min。4℃12 000 g離心15min。取上清,加入500μl異丙醇,將液體混勻,冰上靜置 10 min。4℃12 000 g離心10min。棄上清,加入75%乙醇1 ml,洗滌2次。4℃7 500 g離心 5min,棄上清。晾干后,加入 100μl DEPC中,65℃孵育促溶 10～15 min。

1.2.2 目的cDNA片段的獲取 冰上配置RT反應(yīng)液,5×Prime Script Buffer 2μl,Prime Scrip t RT Enzyme MixⅠ0.5μl,Oligo dT Primer(50μM)0.5 μl,Random 6mers(100μM)0.5μl,總RNA 500 ng,加RNase Free dH2O水至10μl,37℃15 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),85℃5 s使得反轉(zhuǎn)錄酶失活。擴(kuò)增目的基因:冰上配置PCR反應(yīng)液,SYBR Premix Ex TaqTMII(2×)12.5μl,PCR Forward Primer(10μM) 1μl,PCR Reverse Primer(10μM)1μl,RT反應(yīng)液2 μl,滅菌蒸餾水 8.5μl,總體積為25μl。95℃變性1m in,61℃退火1min,72℃延伸3min 30 s,10個循環(huán)。95℃變性1 min,59℃退火1min,72℃延伸3m in 30 s,10個循環(huán)。95℃變性1 min,57℃退火1min,72℃延伸3min 30 s,10個循環(huán)。95℃變性1 min,58℃退火1min,72℃延伸3min 30 s,5個循環(huán)。72℃充分延伸 10 min。4℃終止反應(yīng)。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 取PCR產(chǎn)物0.1μg,10 ×Taq DNA聚合酶1μl,PCR緩沖液1μl,5mmol/ L dATP 0.4μl,Taq DNA聚合酶(3U/μl)0.1μg,加去離子水至總體積 10μl,充分混勻?；旌衔镉?0℃孵育1 h。取加A尾PCR產(chǎn)物0.2 pmol,1μl pUCm-T載體,1μl 10×ligation Buffer,1μl 50% PEG,最后加入1μl T4 DNA Ligase,補(bǔ)充去離子水至10μl,充分混勻,20℃連接1 h。

1.2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及篩選 取 100μl感受態(tài)細(xì)胞,置冰上。完全解凍后將細(xì)胞均勻懸浮。加入5μl連接液混勻,冰上放置30min。42℃熱休克90 s,冰上放置15～20 min。加入400μl SOC培養(yǎng)基, 37℃200～250 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。室溫下4 000 r/m in離心5 min,吸掉400μl上清液,用剩余的培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮。將細(xì)菌涂布在預(yù)先用20μl IPTG和100μl X-gal涂布的氨芐青霉素平板上,37℃下正向放置1 h,然后倒置培養(yǎng)過夜。選擇在平板上生長的白色菌落,用牙簽挑至含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.5 重組質(zhì)粒的酶切鑒定及測序 隨機(jī)挑取白色菌落,接種于2 ml含氨芐西林(50 mg/L)的LB培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng);小量提取質(zhì)粒,用XbaⅠ和ClaⅠ酶切檢測,瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察酶切結(jié)果。送上海生工公司用M13通用引物和T7啟動子引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。用ABI 100 Model 377自動測序儀進(jìn)行全序列測序。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取結(jié)果及RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 提取出總RNA后,測OD值。OD值介于1.8～2.0,RNA提取質(zhì)量較好。在紫外燈下觀察總RNA電泳,可見28 S、18 S和5 S三個條帶,28 S和18 S亮度之比為2∶1,5 S條帶較弱,說明 RNA無降解。逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA第1鏈,用合成的Parkin上、下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng),得到約 1 785 bp的特異性片段,初步鑒定為人Parkin cDNA。

2.2 PCR產(chǎn)物的克隆的鑒定及測序結(jié)果 用XbaⅠ和ClaⅠ酶切可見有1 778 bp,初步鑒定提示有Parkin cDNA的插入。挑選陽性克隆在自動測序儀下測序,結(jié)果經(jīng)Medline Blast查詢,與Gene Bank [NM 004562]所登錄序列完全一致。

3 討論

Parkin基因定位于6q25.2～27,位于遺傳標(biāo)記D6S305和D6S253之間。全長1.5 Mb,有12個外顯子,編碼序列為1 395 bp,所編碼蛋白含465個氨基酸。其是泛素和蛋白的 E3連接酶,能與 E2 UbcH7和UbcH8共同作用,而且Parkin自身也是經(jīng)泛素化調(diào)節(jié)降解。Parkin編碼蛋白在正常人的腦部廣泛表達(dá),特別是黑質(zhì)區(qū),而PD患者腦內(nèi)缺乏Parkin蛋白表達(dá);一旦Parkin變性,可影響某些蛋白降解,從而引起多巴胺類神經(jīng)元的毒性損傷,導(dǎo)致常染色體隱性少年型帕金森病(ARJP)[2]。Parkin蛋白作為一種泛素—蛋白連接酶參與蛋白降解[3,4]。一般大腦中的Parkin蛋白并不以天然的α-synuclein為底物將其泛素化,而是與結(jié)構(gòu)上發(fā)生改變的 αsynuclein蛋白,如翻譯后加工的(O端糖基化或磷酸化)、構(gòu)象改變的(原纖維的纖維化或多聚化)發(fā)生作用。Parkin基因突變常導(dǎo)致Parkin蛋白缺失,功能障礙,酶活性減弱或消失,造成細(xì)胞內(nèi)異常蛋白累積,最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡[5,6]。所以,Parkin蛋白在泛素—蛋白水解酶復(fù)合體通路中發(fā)揮重要作用,是一種多用途的神經(jīng)保護(hù)劑。

本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增到的特異性片段約為 1 395 bp,與預(yù)期片段太小相符;連接入克隆載體后,經(jīng)Pst I酶解,與片段內(nèi)部酶切位點(diǎn)相符,初步鑒定為Parkin cDNA。測序結(jié)果表明該片段與Gene Bank報道完全相符,故可確認(rèn)為Parkin cDNA。此外,在合成引物時加入的Cla I和Xba I酶切位點(diǎn)對今后亞克隆提供了基礎(chǔ),pUCm-T載體具有T7啟動子,可用來合成原位雜交的探針,為今后的工作奠定基礎(chǔ)。

[1]Giasson BI,Lee VM.Are ubiquitination patheays central to Parkinson's disease[J].Cell,2003,114(5):1-8.

[2]KitadaT,Asakawa S,Hattori N,et al.Mutations in theParkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism[J].Nature,1998, 392(6676):605-608.

[3]Tanaka K,Suzuki T,Hattori N,etal.Ubiquitin,proteasome and parkin[J].Biochim Biophys Acta,2004,1695(1-3):235-247.

[4]Shimura H,Hattori N,Kubo S,etal.Familial Parkinson disease gene product,parkin,is a ubiquitin-protein ligase[J].Nat Genet,2000, 25(3):302-305.

[5]Gasser T,Muller-Myhsok B,Wszolek ZK.A susceptibility locus for Parkinson's disease maps to chromosome p13[J].Nat Genet,1998, 18(3):262-265.

[6]Farrer M,Maraganore DM,Lockhart P,et al.A lpha-Synuclein gene haplotypes are associated with Parkinson's disease[J].Hum Mol Genet,2001,10(17):1847-1851.