施佳音,夏鈺弘

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院,江蘇無錫 214023)

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和基底細(xì)胞癌(BCC)為皮膚科常見腫瘤。本研究應(yīng)用免疫組化EnVision二步法檢測NF-κB、Ki-67和E-cad在正常皮膚組織、皮膚SCC和BCC的表達(dá),并進(jìn)行差異比較和相關(guān)性分析,以探討此三者的相關(guān)性及其與皮膚SCC和BCC惡性程度之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 石蠟包埋標(biāo)本來源于我院病理科1990～2005年存檔標(biāo)本,其病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照世界衛(wèi)生組織腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中BCC 30例(男 17例、女 13例,平均年齡 59.6歲,發(fā)生于面部 19例、軀干1l例)、SCC 50例(男32例、女18例,平均年齡61.7歲,發(fā)生于面部33例、軀干 17例)及正常皮膚標(biāo)本20例(分別來自頭、面、軀干)。皮膚SCC標(biāo)本根據(jù)Broders法判斷分級(jí)：其中Ⅰ級(jí)26例,Ⅱ～Ⅲ級(jí)24例。

1.2 方法 兔抗人NF-κB/p50多克隆抗體,克隆號(hào)RAB-0531,即用型;兔抗人Ki-67單抗隆抗體,克隆號(hào)MIB-1,即用型;鼠抗人E-cad單抗隆抗體,克隆號(hào)MAB-0247;購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。免疫組織化學(xué)采用EnVision法,切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟梯度乙醇水化。一抗孵育前切片經(jīng)0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)煮沸抗原修復(fù)。操作步驟按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。二氨基聯(lián)苯胺顯色。選用已知陽性的肺癌組織為陽性對照,以PBS液代替一抗作為空白對照。

1.3 結(jié)果判斷 NF-κB主要在細(xì)胞質(zhì)著色,蛋白染色陽性信號(hào)均呈棕黃色顆粒。Ki-67染色信號(hào)定位于細(xì)胞核,胞核出現(xiàn)深棕色為陽性標(biāo)記。E-cad陽性判斷以細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性,無著色為陰性。根據(jù)顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)兩項(xiàng)指標(biāo)判斷陽性等級(jí)。按顯色強(qiáng)度分為無色、黃色、棕黃色和棕色,分別計(jì)分為 0、1、2、3分,按陽性細(xì)胞占同類細(xì)胞的比例分為：0、＜1/3、1/3～2/3、＞2/3,分別計(jì)分為 0、1、2、3分。然后根據(jù)兩項(xiàng)乘積計(jì)分判斷其結(jié)果。兩者定性積分表達(dá)≤3分為陰性表達(dá),4～5分為弱陽性(+),6～7分為陽性(++),8～9分為強(qiáng)陽性(+++)。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野在100倍視野下計(jì)數(shù),取其平均值以避免隨意性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以率表示,比較采用 χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB在各種組織中的表達(dá) NF-κB在1例正常皮膚中弱陽性表達(dá),陽性率為 5%(1/20)。在BCC和SCC的陽性率分別為60%(18/30)、92.0% (46/50),(χ2=12.0,P＜0.05),表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。在SCCⅠ級(jí)和Ⅱ～Ⅲ級(jí)的總陽性率分別為92.3%(24/26)、91.7%(22/24)(P＞0.05),但在SCCⅠ級(jí)和Ⅱ～Ⅲ級(jí)中的強(qiáng)陽性(++～+++)率分別為30.8%(8/26)、83.3%(20/24),兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=13.9,P＜0.01)。

2.2 Ki-67在各種組織中的表達(dá) Ki-67在1例正常皮膚中弱陽性表達(dá),陽性率為10.0%(2/20)。在BCC和SCC的陽性率分別為66.7%(20/30)、94.0% (47/50),兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=8.383,P＜0.05),表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。在SCCⅠ級(jí)和Ⅱ～Ⅲ級(jí)的總陽性率分別為 92.3%(24/26)、95.8%(23/24),兩者比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.000, P＞0.05),但在SCCⅠ級(jí)和Ⅱ～Ⅲ級(jí)中的強(qiáng)陽性率分別為34.6%(9/26)、91.7%(22/24),兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=17.241,P＜0.01)。

2.3 E-cad在各種組織中的表達(dá) E-cad在正常皮膚陽性率為80%(16/20)。在BCC和SCC的陽性率分別為60%(18/30)、30%(15/50),兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=6.963,P＜0.05),陽性表達(dá)主要以胞膜為主.部分伴胞質(zhì)陽性,強(qiáng)度深淺不等。在SCCⅠ級(jí)和Ⅱ～Ⅲ級(jí)的強(qiáng)陽性率分別為34.6%(9/26)、25%(6/24),兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=4.120,P＜0.05)。

2.4 相關(guān)性分析 皮膚BCC和SCC組織中NF-κB和Ki-67的陽性細(xì)胞表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.31,P＜0.05),NF-κB和E-cad的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.25,P＜0.05)。

3 討論

在細(xì)胞分化、增殖及正常平衡的維持中,基因?qū)Φ蛲龅目刂破痍P(guān)鍵作用。NF-κB是普遍存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子,是由P50和P65(Rel-A)兩個(gè)亞單位構(gòu)成的異源二聚體。以往的研究主要集中在 NF-κB在免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中的作用[1]。最近研究發(fā)現(xiàn),NF-κB在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起重要作用,它可調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及惡性轉(zhuǎn)化[2]。本研究結(jié)果顯示,NF-κB在皮膚BCC和SCC的陽性表達(dá)率顯著高于正常對照組,且在皮膚SCC的陽性表達(dá)率顯著高于BCC。在SCCⅠ級(jí)和Ⅱ～Ⅲ級(jí)中的 NF-κB的總陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但其強(qiáng)陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明NF-κB通過對凋亡基因的控制,參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長,隨著腫瘤分化程度的降低,NF-κB的表達(dá)有明顯增高趨勢。提示NF-κB有助于鑒別腫瘤良惡性及其生長行為方式。

Gerdes等在1983年提出Ki-67是人類所有增殖細(xì)胞核中普遍存在的標(biāo)志性抗原。Ki-67蛋白已用于臨床腫瘤的輔助診斷,并與腫瘤的惡性度、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。本研究中,Ki-67的表達(dá)與年齡、性別、組織類型均無顯著相關(guān)性,但在皮膚BCC和SCC的陽性表達(dá)率顯著高于正常皮膚,且在皮膚SCC的陽性表達(dá)率顯著高于BCC。雖然在SCCⅠ級(jí)和Ⅱ～Ⅲ級(jí)中的總陽性率表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但在SCCⅠ級(jí)和Ⅱ～Ⅲ級(jí)中的強(qiáng)陽性率的進(jìn)一步比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明 Ki-67參與了腫瘤細(xì)胞的異常增殖過程,與惡性程度有關(guān),Ki-67的高表達(dá)與組織的分化程度有關(guān),能較準(zhǔn)確地反映出腫瘤組織的增殖活性,有助于判斷腫瘤組織的生物學(xué)行為。

許多研究表明在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中有E-cad丟失,主要機(jī)制是E-cad丟失導(dǎo)致細(xì)胞間黏附性降低致細(xì)胞脫落,細(xì)胞間的接觸抑制減弱致細(xì)胞過度增殖[3],E-cad對維持組織結(jié)構(gòu)形態(tài)起重要作用。本組中E-cad在BCC的表達(dá)水平較高,因?yàn)锽CC不具有轉(zhuǎn)移性。也有學(xué)者提出E-cad主要起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[4]。本組中E-cad在正常皮膚中呈陽性表達(dá),但在腫瘤組織中的表達(dá)下降,尤以SCC下降明顯;其中在SCCⅡ～Ⅲ級(jí)中的表達(dá)較SCCⅠ級(jí)下降明顯。表明其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的惡性程度有關(guān),與魏志平等[5]的報(bào)道一致。

本研究證實(shí)了隨著腫瘤細(xì)胞分化程度的降低, NF-κB、Ki-67的表達(dá)有增高趨勢,E-cad的表達(dá)有下降趨勢。提示BCC和SCC侵襲性生長與NF-κB、Ki-67的表達(dá)增高有關(guān),SCC易發(fā)生轉(zhuǎn)移的特性與E-cad的低表達(dá)有關(guān)。由此可見,NF-κB、Ki-67和E-cad的表達(dá)與皮膚SCC和BCC的惡性程度、生物學(xué)行為密切相關(guān)。NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能通過對凋亡基因的控制來對Ki-67、E-cad進(jìn)行調(diào)節(jié),進(jìn)而控制腫瘤。

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