呂成林 蘇秀華 崔月榮 張衍俊 （山東省嘉祥縣畜牧獸醫(yī)局 272400）

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附紅細胞體病的病原學及診斷方法研究進展

呂成林 蘇秀華 崔月榮 張衍俊 （山東省嘉祥縣畜牧獸醫(yī)局 272400）

附紅細胞體病(簡稱附紅體病)是由血液寄生生物—附紅細胞體(Eperythrozoon)寄生于紅細胞表面或游離于紅細胞內、血漿、組織液及腦脊液中引起，以發(fā)熱、溶血性貧血和黃疸為主要特征的人畜共患病[1]。該病不僅能造成畜禽生產性能下降，還能導致動物死亡，同時還危害著人類身體健康。因此，自20世紀80年代以來，國內外學者對附紅細胞體病進行了較為深入的研究。

1 豬附紅細胞體病的現(xiàn)狀

附紅細胞體感染早在上世紀20年代就被人們發(fā)現(xiàn)。1928年Schilling和Dinger同時在嚙齒動物體內發(fā)現(xiàn)了類球狀血蟲體。不久，Bartno在嚙齒動物的紅細胞內和紅細胞表面上發(fā)現(xiàn)二分裂菌體。1934年Neitz等在綿羊的紅細胞上或在其周圍發(fā)現(xiàn)有多形態(tài)的微生物，并命名為綿羊附紅細胞體。同年Adler等在牛體內發(fā)現(xiàn)了形態(tài)與球狀血蟲體相似的微生物，命名為溫氏血蟲體。與此同時兒Kinsely等揭示了豬的類邊蟲科微生物所引起的疾病就是附紅細胞體病[2,3]。1950年splittec證實附紅細胞體是引起豬黃疽性貧血的病因，并命名為豬附紅細胞體[3]。

自80年代后，國內外對附紅細胞體感染人及動物發(fā)病的研究越來越多[4]。1986年Puntarie等正式描述了人的附紅細胞體病。在國內，晉希民首先在病兔中發(fā)現(xiàn)兔的附紅細胞體，以后許耀成等[5]在江蘇發(fā)現(xiàn)豬附紅細胞體，華修國[6]在上海首次發(fā)現(xiàn)犬的附紅細胞體病。1982年崔君兆等曾在人體內發(fā)現(xiàn)一種基本特征類似附紅細胞體的微生物，而1983年張汝勇等在5份人血液中就查到了附紅細胞體。隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)的高速發(fā)展，動物飼養(yǎng)密度的增加為傳染性疾病的控制增加，從90年代末期開始有關本病報道日漸增多。至今，我國已有22個省、市、自治區(qū)有該病報道。資料顯示，本病己發(fā)生于人及綿羊、山羊、馬、騾、驢、駱駝、牛、豬、犬、貓、兔、狐、貉、水貂、鼠、雞等多種動物，其中豬發(fā)病的報道占絕大多數(shù)[4]。

豬的附紅細胞體不僅導致畜產品質量和產量的降低，還導致懷孕母豬出現(xiàn)受孕率下降或發(fā)生流產、死胎等現(xiàn)象。更嚴重的是感染了附紅細胞體病的豬免疫機能大大下降，為其它病原體的傳入打開了通道，很多豬場因此損失慘重，所以目前豬的附紅細胞體病已越來越引起我國養(yǎng)豬者的重視[7]。

附紅細胞體的傳播之廣及其對畜牧業(yè)所造成的危害之大，已開始受到各國畜牧獸醫(yī)界、外貿界的嚴重關注，同時這種人獸共患傳染性疾病對人體的危害也正受到醫(yī)學界的注意。附紅細胞體病為全國性分布和全球性分布，遍及全世界，包括南北美洲，非洲，歐洲和亞洲[8]，目前世界各大洲的30多個國家和地區(qū)均有發(fā)生和流行。

2 病原體及生物學特性

附紅細胞體無細胞壁，由單層界膜包裹著，無明顯細胞器和細胞核，多數(shù)為球形、卵圓形、環(huán)行、桿狀等形態(tài)生物體，直徑為0.2~2.6μm，大小不等。起初人們把附紅細胞體歸屬于原蟲，后來又把它歸屬于霉形體目?，F(xiàn)《伯杰氏細菌鑒定手冊》卻又將其單獨列為立克次體目(Rickettsiales)無漿體科(Anaplasmataceae)附紅細胞體屬[9]，然而人們至今仍有學者對此規(guī)類持不同的意見。現(xiàn)今已知附紅細胞體可分為綿羊附紅細胞體(E.Ovis)、山羊附紅細胞體(E.lirci)、牛附紅細胞體(E.teganodes)、牛溫氏附紅細胞體(E.wenynoi)、豬附紅細胞體(E.suis)、豬小附紅細胞體(E.Parvum)、兔附紅細胞體(E.lepus)、鼠球狀附紅細胞體(E.coccoides)、貓附紅細胞體病(E.felis)、犬附紅細胞體(E.perekropovi)、雞附紅細胞體(E.ga11inae)和人附紅細胞體(E.humanus)等14種[10]，不同種的附紅細胞體都有相對的特異性，宿主特異性較強，根據(jù)宿主不同而分別命名方法的準確性，還有待于進一步研究。

近幾年，對病原的基因序列(16SrRNA)分析結果表明，豬附紅細胞體不應屬于立克次氏體，宜將豬附紅細胞體列入柔膜體綱支原體屬(MyocPlasma)(Messick等2000；Messick等2001)，據(jù)此，Neimark等(2001)認為，應將豬附紅胞體改名為豬嗜血性支原體(MycoPlasma hamosuis)[11]。但直到目前，在世界范圍內對該病病原體的歸屬尚未取得統(tǒng)一意見。.

附紅細胞體的形態(tài)結構有所差異，表現(xiàn)出多樣性。在普通光學顯微鏡和電子顯微鏡下觀察新鮮血片時發(fā)現(xiàn)附紅細胞體是一種典型的原核生物，是多形態(tài)生物體(尚德秋，1994)，有球形、條形、卵圓形、星形、點狀、桿狀[12~16]，大小為0.2~1.3μm或0.5~2.6μm，無細胞壁，僅有單層界膜，呈點狀、桿狀。整個結構呈單層膜包被的原盤狀[3]，常附著于紅細胞表面，有的游離于血漿中左右搖擺，前后爬行，呈翻滾或扭轉等多種形式的運動。一個紅細胞上一般可附1~15個蟲體，其中6~7個多見，被附著的紅細胞變成齒輪狀、星芒狀、菠蘿狀或不規(guī)則形狀。還有人報道附紅細胞體附于紅細胞表面時呈鑲角狀，稱為“鑲角紅細胞”[17]。豬附紅細胞體呈圓形、卵圓形等多種形態(tài)，平均直徑為0.2~2μm，單獨或成鏈狀附著于紅細胞體表面，或圍繞在整個紅細胞上，無鞭毛。附紅細胞體在發(fā)育過程中，大小和形狀也可以發(fā)生改變，以往所沒有致病力的小附紅細胞體實際是豬附紅細胞體的未成熟階段或是前體。

附紅細胞體對于干燥和化學藥劑抵抗力弱，凍干保存可存活2d[3]，一般常用消毒藥均能殺死病原，如在0.5%石炭酸中37℃3h就可以被殺死。加入0.1%的碘酒，可以立即停止運動，不易被碘著色；5%的醋酸溶液中可刺激其運動。陸宙光等[17]人報道不同濃度的革蘭氏液使附紅細胞體有不同的反應。如向含有附紅細胞體血樣中加入2倍量的革蘭氏液時，附紅細胞體附于紅細胞表面，不活動；若加入血液半量的革蘭氏液，附紅細胞體離開紅細胞，在血液中作旋轉運動。同時他還發(fā)現(xiàn)5%碘液和丙種球蛋白對附紅細胞體有制動作用，都能使附紅細胞體運動停止，且丙種球蛋白還能使附紅細胞體凝集成團。但對低溫的抵抗力強，侯順利等人[16]通過把含附紅細胞體的抗凝血放入4℃冰箱進行保存試驗，發(fā)現(xiàn)附紅細胞體可存活30d以上。在冰凍凝固的血液中可存活31d，在加了15%甘油的血清中-79℃可保持感染力80d，有報道指出附紅細胞體可長期寄居于動物體內，病愈后的動物可終身攜帶。

3 病原學檢查

血涂片染色鏡檢：附紅細胞體血涂片對各類的染色均容易著色[18]。通過姬姆薩染色，紅細胞一般呈紫紅色，附紅細胞體有折光性，外面有白色的環(huán)，瑞氏染色時紅細胞一般呈淡紫紅色，附紅細胞體一般呈天藍色，根據(jù)著色深淺，顏色有所改變，每個紅細胞上附著的附紅細胞體的數(shù)目各異，中度感染一般為6~7個；重度感染的時可達到20個以上，此時紅細胞暗視野下如同鋸齒狀，附紅細胞體染色的鏡檢形狀與鮮血懸滴的鏡檢情況相同，但染色時要注意區(qū)分附紅細胞體與染料沉淀物的區(qū)別。

電鏡觀察：電鏡下的紅細胞表面的附紅細胞體多為球狀，餅狀，卵圓形，短桿狀等多種形態(tài)。大小為0.2~2.6nm。單個的附紅細胞體則成球狀，餅狀等多形態(tài)[6]。其中，球狀附紅細胞體上常見有一根到數(shù)根細長狀結構，附著在紅細胞表面上，則使紅細胞膜產生一些小而深凹陷的變形。

鮮血懸滴鏡檢：取靜脈血或心血1滴加4~6滴的生理鹽水混勻，用蓋玻片覆蓋。調節(jié)光圈至較暗，高倍鏡下即可見震顫和變形的血球以及呈淡綠色熒光的附紅細胞體。在油鏡下可見菠蘿樣、鋸齒狀、星芒狀紅細胞。紅細胞內和血漿中可見附紅細胞體，大多呈球形、逗號形、條形細小顆粒狀[6]。有附紅細胞體的紅細胞可見明顯震顫和小移動。血漿中游離的附紅細胞體有明顯的翻滾、伸縮、擺動等運動和不同方位的移動。

動物實驗：不作常規(guī)之用，適用于附紅細胞體病研究時使用。以含附紅細胞體的紅細胞作兔靜脈接種4~8d為附紅細胞體的高峰期，15d后消失。也有使用雞、小白鼠為動物模型的[6,12]。

4 血清學檢查

用血清學方法不僅可用于診斷，還可以進行流行病學調查和疾病檢測。但對附紅細胞體的血清學診斷方法國內研究較少，國外研究較多。目前報道的方法有：補體結合試驗：1958年Splitter率先用于診斷豬的附紅細胞體病。病豬出現(xiàn)癥狀后的1~7d呈陽性反應，但2~3周后即可轉為陰性。該方法用于診斷急性病豬效果較好。但慢性病豬均呈陰性反應[3]。

間接血凝試驗：該方法是1975年由Smith研究成功，并將間接血凝試驗滴度1:40定為陽性。該法靈敏度較高，能檢出補體結合反應轉陰后的耐過豬[3]。

熒光抗體技術：該方法是1970年由華松最早用來診斷牛附紅細胞體病，抗體在感染后的第4天出現(xiàn)，并隨著感染率的上升而上升，第28d達到高峰[3]。

酶聯(lián)免疫吸附試驗：該方法是1976年由Lang等用去掉綿羊紅細胞的綿羊附紅細胞體抗原進行試驗，認為此法的敏感性較間接血凝試驗高8倍。1992年HusFrank Hill等對檢測豬的附紅細胞體與間接血凝實驗結果進行比較分析，兩者之間差異顯著，認為是一種敏感、快速、特異的檢測方法。用此法檢查診斷附紅細胞體病是近幾年才發(fā)展起來的。張浩等[19]建立起了單抗捕捉ELISA檢測豬附紅細胞體血清抗體方法，朱凝瑜[20]等建立起了雙抗夾心ELISA方法診斷豬的附紅細胞體病。

分子生物學診斷：關于附紅細胞體病的分子生物學檢測和診斷方面主要見于豬附紅細胞體，Oberst(1991)在噬菌體gtⅡ構建了豬附紅細胞體DNA文庫，并篩選出KSU-2克隆作為診斷探針，與感染豬附紅細胞體的豬血抽提的DNA雜交反應較好，且不與未感染豬附紅細胞體的血所抽提的DNA反應。隨后Oberst(1993)又利用PCR一DNA雜交技術分別檢測出感染豬附紅細胞體病豬血液中的病原體。Gwaltney(1993)用組織原位雜交和電鏡相結合對血液樣品中的附紅細胞體進行了檢測，并且建立了利用PCR技術檢測豬附紅細胞體的技術，最低檢測基因組量為450pg，對脾臟切除豬人工感染后24h即可檢測出，1994年他又對豬實驗性感染豬附紅細胞體后血液樣品進行了PCR檢測和間接血凝試驗抗體檢測比較，證實PCR方法優(yōu)于間接血凝試驗，且青年豬感染后抗體產生少。Vandervoort(2001)也用PCR技術對牛群中牛附紅細胞體的感染進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)PCR技術比血液涂片敏感性要高得多，甚至可以檢測出涂片為陰性的病例。對豬的附紅細胞體的分子生物學檢測和診斷，不僅為臨床上更好的控制該病提供了很好的保障，也為進一步研究該病的發(fā)病機制提供了很好的手段，對其他動物的附紅細胞體病的研究也是很好的借鑒。根據(jù)16SrRNA基因設計引物(Messick JB等，1991)，Brinson等(2001)用于狗附紅細胞體檢查，Bernet等(1998)用于貓的附紅細胞體體檢測，目前我國一些學者也用于豬的附紅細胞體的檢測，如賈杏林[21]等比較了PCR和染色鏡檢方法對豬附紅細胞體病的診斷，這種分子生物學診斷技術特異性和敏感性高，可用于流行病學調查和臨床檢查。

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（2011–06–13）

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1007-1733(2011)08-0084-03