金娟，田偉

(1.沈陽醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院2008級臨床醫(yī)學4班，遼寧 沈陽 110034;2.解剖學教研室)

小腸黏膜下基質(zhì) (small intestine submucosa，SIS)是一種不含細胞的天然細胞外基質(zhì)材料。它有良好的細胞相容性，可促進多種細胞在材料上的黏附、生長和分化［1－2］。在超過1 000次的跨種交叉移植實驗中，均表現(xiàn)為無免疫原性，而且直接免疫激惹實驗無應(yīng)答反應(yīng)。體內(nèi)降解速度也較快。與合成材料相比，所提供的環(huán)境和纖維結(jié)構(gòu)更有利于細胞的生存、擴展及新陳代謝［3］。如將SIS植入宿主體內(nèi)，可迅速誘導細胞浸潤，刺激血管生成和宿主細胞生長分化，產(chǎn)生的再生組織在結(jié)構(gòu)和功能上均與原有組織相似。研究表明SIS基本符合組織工程理想支架材料的條件，極有可能在組織體內(nèi)完全再生。已用于包括血管在內(nèi)的多種組織的重建［4－10］。本文就近年來諸多學者對SIS作為組織工程學中支架材料的研究報道加以綜述。

1 SIS特性與優(yōu)點

SIS由一層致密的結(jié)締組織構(gòu)成，其主要成份為Ⅰ和Ⅲ型膠原纖維，另含有少量Ⅴ和Ⅵ型膠原纖維，所含細胞較少。SIS含有多種生長因子，對組織的修復重建及細胞的生長有重要作用，其結(jié)構(gòu)非常有利于細胞的黏附、增殖和分化，并且能刺激細胞分泌膠原等，因而具有良好的生物相容性和適當?shù)臋C械特性，能承受周圍組織壓力，為再生細胞提供足夠的生長空間，能迅速誘導細胞浸潤、刺激血管生成和宿主細胞的長入和分化，逐漸完全降解，產(chǎn)生的再生組織在結(jié)構(gòu)和功能上均與原有組織相似。

2 SIS制備

2.1 物理方法處理 取經(jīng)過檢疫的健康成年豬的空腸，運輸過程中將小腸冰凍冷藏，在4h內(nèi)完成清潔過程。用裹有紗布的刀柄去除小腸的漿膜層和肌層，其間持續(xù)用40℃水沖洗［11］。

2.2 化學方法處理 按Abraham方法［12］進行脫細胞和消毒、滅菌處理物理方法處理后的小腸。既沒有細胞碎屑，又不損害小腸黏膜下層膠原的成分，降低免疫反應(yīng)的程度，適合作修復材料［13］。

3 SIS在組織重建中的應(yīng)用

3.1 體外構(gòu)建組織工程骨膜的實驗研究 取2月齡新西蘭大白兔，自脛骨上段前內(nèi)側(cè)穿刺抽取骨髓4ml，制成骨髓間充質(zhì)干細胞 (bone mesenchymal stem cell，BMSC)懸液，并傳代培養(yǎng)。將傳至第三代的細胞與SIS材料復合。相差顯微鏡觀察:第7d后材料周圍有較多細胞直接貼附于材料邊緣。10d后大量細胞聚集材料邊緣。細胞形態(tài)多為梭形及多角形。掃描電鏡觀察:復合培養(yǎng)5d，細胞散在材料表面，呈長梭形或不規(guī)則形，細胞間無連接。胞體表面有顆粒狀物，可見微絲形成并附著在材料表面。培養(yǎng)7d以后細胞數(shù)量明顯增多，細胞分泌旺盛，細胞間有大量膠原纖維絲，形成細胞間連接。部分細胞跨越孔隙，呈長梭形，有些正在分裂，有些重疊生長。培養(yǎng)10d以后細胞數(shù)量增多連成一片。2周時細胞數(shù)量更多，細胞層數(shù)也逐漸增加。細胞分裂增殖呈三維生長，細胞分泌大量細胞外基質(zhì)，開始呈蜂窩狀，縫隙逐漸被細胞外基質(zhì)填塞而變得致密，細胞輪廓也變得模糊。SIS與BMSC復合培養(yǎng)4周，細胞通過細胞外基質(zhì)緊密連接，結(jié)構(gòu)連接致密。材料表面有多層細胞附著、增殖。McDevitt等［14］從 SIS中提取出轉(zhuǎn)化生長因子-β，盡管在制備過程中經(jīng)受過消毒、凍干等處理，仍具有生物活性，既可以促進BMSC分化、增殖，又能刺激成骨細胞和成軟骨細胞增殖，增加Ⅰ型膠原、骨連接蛋白和骨橋蛋白合成。SIS與BMSC在體外復合培養(yǎng)可以構(gòu)建出類似生物骨膜的組織工程骨膜，為進一步研究體內(nèi)成骨奠定了基礎(chǔ)［15］。

3.2 尿道結(jié)構(gòu)和功能重建方面的實驗研究 應(yīng)用豬小腸黏膜下層進行兔尿道缺損修補。SIS具有良好的促再生特性，應(yīng)用SIS修復的尿道缺損，可減少尿瘺和尿道狹窄的發(fā)生，術(shù)后4周可見上皮細胞再生，新生血管長入;術(shù)后12周其基本組織結(jié)構(gòu)與正常尿道無明顯差異，行逆行尿道造影顯示，再生尿道的管腔與正常尿道無明顯差異，表明SIS作為尿道修復重建的替代材料，不僅能實現(xiàn)組織學再生，而且可同時實現(xiàn)功能的重建［16］。

3.3 修復兔下頜骨缺損的實驗研究 用豬SIS與納米 β-磷酸三鈣 (β-tricalcium phosphate，β-TCP)結(jié)合的復合支架材料，修復兔下頜骨缺損。復合支架組織骨密度較高，新生骨小梁形態(tài)較成熟。常躍文等［17］將SIS與β-TCP混合，修復大段骨缺損，結(jié)果顯示這種復合骨支架材料表現(xiàn)出良好的成骨特性和組織相容性。豬SIS與納米β-TCP復合支架材料，具有良好的成骨特性和組織相容性，能夠有效地修復下頜骨缺損。

3.4 豬小腸黏膜下層替代兔跟腱的實驗研究 用豬小腸黏膜下層制成SIS，用制成的SIS替代兔跟腱。SIS替代肌腱的過程是代謝過程，經(jīng)過16周，SIS為宿主肌腱完全替代，其組織結(jié)構(gòu)和力學性能與正常肌腱極其接近，實現(xiàn)了組織工程的最終目標，即完全再生。體內(nèi)組織工程理論至少在肌腱再生方面是可行的［18］。

3.5 橋接周圍神經(jīng)缺損的實驗研究 健康的SD大鼠，造成坐骨神經(jīng)10mm缺損，用SIS橋接。于術(shù)后6周和10周取材，可見有再生神經(jīng)組織長過缺損，呈條索狀連續(xù)樣，且神經(jīng)纖維多集中在SIS形成的橋接管周緣區(qū)域，而中心區(qū)域可見膠原組織和孔隙較多。可見再生神經(jīng)遠端有毛細血管形成，未見大量淋巴細胞浸潤，無明顯的免疫排斥現(xiàn)象。SIS作為一種天然的細胞外基質(zhì)，其促進周圍神經(jīng)軸突的具體作用機制尚不清楚。SIS中不僅含有大量的膠原組織，還含有透明質(zhì)酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素A和硫酸皮膚素等氨基葡聚糖，由于多種細胞因子如神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)等需要特定的蛋白多糖來連接它們的受體從而發(fā)揮效應(yīng)。故SIS有可能通過其含有的大量蛋白聚糖而利于細胞因子的黏附和發(fā)揮作用，從而進一步促進神經(jīng)軸突的生長。另一方面，SIS中可提取的細胞因子主要包括FGF-2、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等。FGF-2不僅對多種體外培養(yǎng)的神經(jīng)元具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，而且在周圍神經(jīng)損傷后的退變與再生中起著重要的作用。推測SIS通過其含有的多種氨基葡聚糖和細胞因子而起到促進神經(jīng)軸突生長的作用。另外，SIS表面所具有的三維結(jié)構(gòu)也利于神經(jīng)軸突的生長。從本實驗可見SIS具有促進周圍神經(jīng)軸突生長、修復周圍神經(jīng)缺損的作用?？傊?，SIS作為一種天然的生物材料，具有其特有的生物學特性，有望成為自體神經(jīng)的替代材料而應(yīng)用于周圍神經(jīng)缺損的修復［19］。

3.6 作為組織工程半月板支架材料 有人［13］通過SIS半月板纖維軟骨細胞與小腸黏膜下層復合培養(yǎng)。相差顯微鏡觀察:72h后大部分細胞貼壁，細胞伸長，形成突起，呈梭形或多角形，隨細胞數(shù)量增加，形態(tài)趨于一致，胞核大而圓、2～3個核仁，胞漿豐富，胞漿透明度好且分布均勻，內(nèi)含分泌顆粒。第5d有較多細胞直接貼附于材料邊緣，細胞形態(tài)和數(shù)量與單獨培養(yǎng)細胞時的細胞形態(tài)和數(shù)量相同。第7d有大量細胞向材料邊緣聚集，細胞形態(tài)多為梭形或多角形，連成一片。掃描電鏡觀察:復合培養(yǎng)5d時結(jié)果可見細胞間無連接，胞體表面有顆粒狀物，可見微絲形成，附著在材料表面，隨著時間的推移，細胞間開始有突起相連接，培養(yǎng)7d后細胞增多、分泌，細胞間通過突起相互連接，或伸出偽足帖附于支架孔隙壁上，部分細胞跨越孔隙，有的細胞重疊生長或正在分裂，細胞呈梭形或多角形。實驗表明SIS作為組織工程半月板支架材料，有著巨大的應(yīng)用潛力。

4 存在的問題

SIS用于腹壁的修復、膀胱的重建、硬腦膜的重建、跟腱的修補和回盲部的修補、小動物眼科臨床上，并且取得了滿意的療效。但目前很多研究仍處于實驗階段，還有一些問題有待于解決，特別是組織工程用細胞支架材料植入體內(nèi)后，材料的降解與細胞功能發(fā)揮是否同步，會不會產(chǎn)生遺傳物質(zhì)的改變、基因表達或基因突變等問題［20－21］。目前涉及神經(jīng)修復的研究還不多，其中橋接周圍神經(jīng)缺損的實驗，雖然從病理檢查和電生理檢查結(jié)果來看，SIS橋接神經(jīng)組比自體神經(jīng)移植組略差，但是我們可以通過進一步研究和探討，包括構(gòu)建有利于神經(jīng)軸突生長的三維構(gòu)型、引入各種促進神經(jīng)軸突生長的細胞、細胞因子及構(gòu)建利于神經(jīng)軸突生長的微環(huán)境等，從而來改進SIS促進神經(jīng)軸突生長的效果。除此之外，現(xiàn)有的生物材料在機體內(nèi)易與周圍組織粘連，在SIS制作過程中如何選用適合的生物涂層，防止其與周圍組織粘連仍需要解決。隨著各種相關(guān)基礎(chǔ)研究的深入及臨床應(yīng)用的探索，SIS將在細胞相容性、可控制的降解率、力學強度上得到提高，在組織修復中發(fā)揮更大的作用［22－24］。

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