柴美清，原佳敏

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)研究中心，山西太原030006）

種質(zhì)資源是玉米育種的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，育種成效的大小取決于擁有優(yōu)異種質(zhì)數(shù)量的多少。因此，對玉米種質(zhì)遺傳多樣性深入認(rèn)識是合理利用種質(zhì)的前提。多年來，玉米種質(zhì)間的人工雜交構(gòu)成的復(fù)合群體，形成了一些新的變異類型種質(zhì)，很難用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)或細(xì)胞學(xué)的方法進(jìn)行鑒定評價(jià)；同工酶標(biāo)記也曾被用于玉米種質(zhì)遺傳關(guān)系研究，但由于標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)量有限，表現(xiàn)出一定的局限性[1-3]。

SSR標(biāo)記是依據(jù)作物群體間的遺傳距離或親緣關(guān)系對群體進(jìn)行分類的一種手段，它以揭示基因組DNA的變異為基礎(chǔ)。理論上，它可體現(xiàn)單個核苷酸的差異。因此，SSR分子標(biāo)記在數(shù)量上幾乎是無限的。與其他的遺傳標(biāo)記相比，其具有直接以DNA表現(xiàn)、標(biāo)記數(shù)量多、遺傳穩(wěn)定、多態(tài)性豐富、呈共顯性或顯性、無組織器官特異性、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)[4-5]，彌補(bǔ)了長期以來在親本選配上以表現(xiàn)型差異確定遺傳距離的不足，是最為理想的遺傳標(biāo)記，給玉米種質(zhì)資源的研究提供了新的技術(shù)途徑。

本文主要闡述近年來利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行玉米種質(zhì)研究取得的一些進(jìn)展，以供玉米育種者參考。

1 SSR分子標(biāo)記的原理

SSR分子標(biāo)記是以DNA序列的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，它可以反映生物個體和群體基因組的差異，而這種差異通過將基因組限制性內(nèi)切酶酶切、PCR擴(kuò)增、分子雜交等技術(shù)，可在凝膠電泳上檢測出來。

在高等生物基因組中普遍存在著1～6個堿基組成的簡單重復(fù)序列SSR，通常又稱微衛(wèi)星DNA，因其重復(fù)次數(shù)不同而造成多態(tài)性。微衛(wèi)星位點(diǎn)兩側(cè)序列是相當(dāng)保守的單拷貝序列，因此，可以根據(jù)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)1對特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后經(jīng)高濃度瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)EB或銀染色，從而精確地檢測出待定位點(diǎn)微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性。這種長度多態(tài)性反映了不同基因型個體在特定微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)的多態(tài)性。

2 SSR分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

2.1 指紋圖譜的構(gòu)建

對品種遺傳本質(zhì)DUS（特異性、一致性、穩(wěn)定性）的客觀描述是品種鑒定和保護(hù)的前提。SSR分子標(biāo)記建立的品種指紋圖譜已用于品種鑒定。指紋圖譜是鑒定品種、自交系的有力工具，它具有高度的個體特異性、迅速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在檢測種子真?zhèn)魏图兌?、利用?yōu)良自交系及保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)等方面均有重要的意義。

李曉輝等[6-7]從220對引物中篩選出多態(tài)性豐富的58對引物，以21份玉米自交系和組配的13個雜交種為材料，進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，用2個或3個引物組合構(gòu)建SSR圖譜，可將13個雜交種區(qū)分。王風(fēng)格等[8]用SSR技術(shù)構(gòu)建的中國玉米品種DNA指紋庫，將是國家品種質(zhì)量鑒定的重要依據(jù)。

2.2 玉米雜種優(yōu)勢群的劃分

雜種優(yōu)勢是玉米品種選育的基本理論依據(jù)，雜種優(yōu)勢群及雜種優(yōu)勢模式的概念已為玉米育種工作者普遍接受。20世紀(jì)末，育種家以不同時期雜交種中主要親本所占百分比對我國的玉米種質(zhì)進(jìn)行了探討，通過種質(zhì)系譜、地理來源分析對我國玉米自交系進(jìn)行了初步的類群劃分，也有學(xué)者以植株的某些性狀的總配合力效應(yīng)值為依據(jù)對自交系進(jìn)行了分類[9]。將玉米優(yōu)良自交系劃分成不同雜種優(yōu)勢群，進(jìn)而建立玉米的雜種優(yōu)勢模式，已成為玉米育種的一個重要研究方向。

國內(nèi)外學(xué)者利用SSR標(biāo)記進(jìn)行了雜種優(yōu)勢群劃分，大多取得了很好的結(jié)果。聶永心等[10]利用SSR標(biāo)記進(jìn)行雜種優(yōu)勢群的劃分，將20份玉米自交系劃分為5個類群，分類結(jié)果與系譜基本一致，劃群后群間平均距離大于群內(nèi)平均距離，群間平均產(chǎn)量大于群內(nèi)平均產(chǎn)量。李新海等[11]用UPGMA方法將70份玉米自交系劃分為四平頭，旅大紅骨，PA，PB，BSSS，Lancaster這 6 個類群，劃群結(jié)果與其系譜分析和育種家經(jīng)驗(yàn)基本相符。Smith等[12]利用SSR標(biāo)記對37份玉米自交系進(jìn)行了劃群，并得到較為滿意的結(jié)果。

2.3 玉米自交系遺傳變異的研究

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記已成為作物遺傳育種研究的重要手段，同時為評價(jià)玉米的遺傳變異提供了方便、快捷的研究方法。SSR分子標(biāo)記能夠從本質(zhì)上揭示其變異規(guī)律，并用群體中某一位點(diǎn)等位基因數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)百分率、每個位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)、多態(tài)信息量（PIC）等指標(biāo)評價(jià)玉米種質(zhì)遺傳多樣性，現(xiàn)已成為分析自交系遺傳變異的有效工具。李凌雨等[13]利用10對SSR引物在10份玉米自交系中共檢測出40個等位基因變異，平均多態(tài)信息含量值為0.65。李新海等[14-15]利用43對SSR引物在21份玉米自交系中共檢測出127個等位基因變異，平均每對SSR引物檢測等位基因?yàn)?.95個。

2.4 玉米新品種純度及真?zhèn)蔚蔫b定

種子純度是評定種子質(zhì)量等級的主要依據(jù)，玉米雜交種子純度鑒定是玉米種子質(zhì)量控制體系中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在玉米雜交種生產(chǎn)與銷售過程中，建立以質(zhì)量檢測為中心的良種繁育與種子管理體系，對穩(wěn)定和推廣優(yōu)良品種起重要作用。

蛋白質(zhì)和同工酶電泳是目前常用的玉米雜交種純度室內(nèi)檢測技術(shù)，多數(shù)玉米雜交種和自交系能夠用這種方法鑒別，但由于蛋白質(zhì)和同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，產(chǎn)生的多態(tài)性有限，對親緣關(guān)系較近及遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜的材料難以鑒別，還有一些雜交種應(yīng)用這2種方法得出的室內(nèi)純度檢驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際純度不符。SSR分子標(biāo)記是近年來發(fā)展起來的，建立在PCR基礎(chǔ)上的新型的DNA指紋技術(shù)，具有可靠性強(qiáng)、重復(fù)性高、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)[8]。同時，由于SSR標(biāo)記呈共顯性，在玉米雜交種的純度和真?zhèn)舞b定方面具有明顯優(yōu)勢，目前玉米數(shù)據(jù)庫已公布了1 700多對SSR引物，為SSR技術(shù)在玉米品種純度鑒定上的應(yīng)用提供了有利條件。李群等[16]以登海11號玉米雜交種和9對SSR位點(diǎn)引物為材料，建立了一套利用SSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行玉米雜交種純度鑒定的技術(shù)規(guī)程。李素玲等[17]以強(qiáng)盛1號和6對SSR位點(diǎn)引物為材料，建立了一套簡單、快速、準(zhǔn)確、可靠的種子純度鑒定方法。

3 存在問題與應(yīng)用前景

SSR技術(shù)必須針對每個染色體座位的微衛(wèi)星，發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列，才能設(shè)計(jì)引物，這給微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)帶來一定的困難。

選擇遺傳多態(tài)性高的SSR引物組成核心引物，可以快速、有效地對供試材料進(jìn)行遺傳差異分析，但這些引物首先需要能夠產(chǎn)生穩(wěn)定且易區(qū)分的帶型，其次需要具有較高的PIC，此外，最好均勻地分布于不同染色體上。

結(jié)合育種實(shí)踐分析，目前，我國玉米生產(chǎn)存在2個最常用的雜種優(yōu)勢模式：北方春玉米區(qū)為四平頭和旅大紅骨×Lancaster，黃淮海夏玉米區(qū)為四平頭和旅大紅骨×PA。雜種優(yōu)勢群的鑒定與雜種優(yōu)勢模式原理對選育新型自交系或雜交組合具有重要指導(dǎo)意義。

在SSR分子標(biāo)記的應(yīng)用中，應(yīng)考慮幾個問題：利用SSR分子標(biāo)記挖掘、鑒定與玉米高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性有關(guān)的新基因；積極尋找與目標(biāo)農(nóng)藝性狀基因緊密連鎖經(jīng)濟(jì)高效的分子標(biāo)記；分子標(biāo)記與形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記等技術(shù)有機(jī)結(jié)合，以獲得對玉米種質(zhì)的完整評價(jià)；簡化SSR分子標(biāo)記技術(shù)，降低成本。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展和DNA分子標(biāo)記技術(shù)的日臻完善，SSR分子標(biāo)記必將為玉米種質(zhì)的進(jìn)一步深入研究利用搭建技術(shù)平臺。SSR分子標(biāo)記在玉米種質(zhì)遺傳多樣性評價(jià)、品種鑒定、指紋圖譜繪制、雜種優(yōu)勢群劃分和雜交種純度鑒定等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

［1］劉紀(jì)麟.玉米育種學(xué) [M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：414-417.

［2］張仁和，薛吉全，毛建昌，等.DNA分子標(biāo)記與玉米種質(zhì)研究[J].玉米科學(xué)，2005，13（3）：14-16.

［3］吳景鋒.我國主要玉米雜交種種質(zhì)基礎(chǔ)評述[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1983（2）：1-8.

［4］蘇志芳，包阿東，馬慶.SSR標(biāo)記技術(shù)及其在小麥遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2008（2）：22-24.

［5］金鳳媚，薛俊，夏時云，等.SSR標(biāo)記技術(shù)在番茄遺傳育種上的應(yīng)用[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，10（4）：13-17.

［6］李曉輝，李新海，李文華，等.SSR標(biāo)記技術(shù)在玉米雜交種種子純度測定中的應(yīng)用[J].作物學(xué)報(bào)，2003，29（1）：63-68.

［7］李凌雨，孟全業(yè)，王學(xué)雄，等.60個玉米自交系的SSR標(biāo)記分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（3）：25-29.

［8］王鳳格，趙久然，郭經(jīng)倫，等.中國玉米新品種DNA指紋庫建立系列研究[J].玉米科學(xué)，2003，11（4）：3-6.

［9］史桂榮.東北早熟春玉米主要種質(zhì)優(yōu)勢類群的劃分[J].玉米科學(xué)，2001，9（4）：27-30.

［10］聶永心，張麗，潘光堂，等.SSR分子標(biāo)記在玉米雜種優(yōu)勢群劃分中的應(yīng)用[J].玉米科學(xué)，2004，12（3）：26-29.

［11］李新海，袁力行.利用SSR標(biāo)記劃分70份我國玉米自交系的雜種優(yōu)勢群[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（6）：622-627.

［12］Smith JSC，Chin EC L，Shu H，etal.An evalution ofutility of SSR lociasmolecularmarkers inmaizee（Zeamays L.）：Comparision with date from RFLP and pedegree[J].Theory Appl Genetic，1997，95：163-173.

［13］李凌雨，榎宏征，濃沼圭一，等.SSR標(biāo)記用于玉米自交系類群劃分的研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，30（4）：19-22.

［14］李新海，傅駿驊，張世煌，等.利用SSR標(biāo)記研究玉米自交系的遺傳變異[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，33（2）：1-9.

［15］余花娣，陳景堂，黃亞群，等.利用DNA指紋圖譜進(jìn)行農(nóng)作物品種鑒定的研究進(jìn)展 [J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（5）：28-30.

［16］李群，李汝玉，顏廷進(jìn)，等.應(yīng)用SSR標(biāo)記技術(shù)鑒定登海11號玉米雜交種純度的研究[J].種子，2004，23（10）：21-23.

［17］李素玲，張君捷，柴美清，等.應(yīng)用SSR標(biāo)記技術(shù)鑒定玉米雜交種的純度[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（1）：36-38.