1 材料

1.1 藥物

異麥芽低聚糖、低聚果糖等低聚糖購自廣東溢多利生物科技股份有限公司。

1.2 菌種

雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.3 培養(yǎng)基

BS培養(yǎng)基、LBS培養(yǎng)基、BL肉湯培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基均自制。

2 方法

2.1 復(fù)合低聚糖的制備

將異麥芽低聚糖、低聚果糖按一定比例進(jìn)行混合，均勻攪拌。

2.2 低聚糖培養(yǎng)基的制備

將復(fù)合低聚糖分別按1%、3%、5%加入BL肉湯、MRS液體培養(yǎng)液和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，制備成濃度分別為1%、3%、5%的BL肉湯、MRS液體和營(yíng)養(yǎng)肉湯復(fù)合低聚糖培養(yǎng)基，同時(shí)配制不含復(fù)合低聚糖的BL肉湯、MRS液體和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為正常對(duì)照組。將不同濃度的BL肉湯、MRS液體和營(yíng)養(yǎng)肉湯復(fù)合低聚糖培養(yǎng)基及不含復(fù)合低聚糖的BL肉湯、MRS液體和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至7.22、6.25和6.83，以5 mL/管分裝。

2.3 菌液的制備

將雙歧桿菌、乳酸桿菌經(jīng)復(fù)活后，各取一定的純菌液分別接種于5 mL的BL肉湯和5mL的MRS液體培養(yǎng)基中。37 ℃，48 h厭氧培養(yǎng)后，用無菌生理鹽水水洗3 次（2 500 r/min×5 min）。用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌液濃度為6×108CFU/mL，經(jīng)純菌檢查證實(shí)為無污染的純細(xì)菌懸液。將大腸桿菌復(fù)活后，取一定的純菌液接種于5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃搖床，18 h培養(yǎng)后，經(jīng)純菌檢查證實(shí)為無污染的純細(xì)菌懸液。

2.4 培養(yǎng)計(jì)數(shù)

取含不同濃度的BL肉湯、MRS液體和營(yíng)養(yǎng)肉湯復(fù)合低聚糖培養(yǎng)基各1 支作為試驗(yàn)組，其中1%、3%、5%的BL肉湯復(fù)合低聚糖培養(yǎng)基標(biāo)示為1、2、3，1%、3%、5%的MRS液體復(fù)合低聚糖培養(yǎng)基標(biāo)示為4、5、6，1%、3%、5%的營(yíng)養(yǎng)肉湯復(fù)合低聚糖培養(yǎng)基標(biāo)示為7、8、9；取不含復(fù)合低聚糖的BL肉湯、MRS液體和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基管各1 支作為對(duì)照組，標(biāo)示為A、B、C。將上述各管分別加入制備好的雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌懸液0.1 mL，37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h取出，在620 nm下側(cè)定吸光值。

3 結(jié)果與分析

從表1可以看出，雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌在各自的培養(yǎng)基中，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，數(shù)量都增加，在0～6 h生長(zhǎng)較慢，6～16 h生長(zhǎng)較快，增加幅度較大，16～24 h生長(zhǎng)較平穩(wěn)。雙歧桿菌在不同濃度的復(fù)合低聚糖培養(yǎng)基中都得到大量繁殖，生長(zhǎng)速度及生長(zhǎng)數(shù)量與不含復(fù)合低聚糖的培養(yǎng)基相比更大，但3%、5%的復(fù)合低聚糖培養(yǎng)基基本相同，比1%的復(fù)合低聚糖培養(yǎng)基快而多；乳酸桿菌在不同濃度的復(fù)合低聚糖培養(yǎng)基中也都得到大量繁殖，生長(zhǎng)速度及生長(zhǎng)數(shù)量與不含復(fù)合低聚糖的培養(yǎng)基相比更大，但3%、5%的復(fù)合低聚糖培養(yǎng)基基本相同，比1%的復(fù)合低聚糖培養(yǎng)基快而多；而大腸桿菌在不含復(fù)合低聚糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)快，數(shù)量多，而在不同濃度的復(fù)合低聚糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度緩慢，生長(zhǎng)數(shù)量雖然增多，但幅度不大。

表1 雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌在不同濃度的復(fù)合低聚糖的生長(zhǎng)的情況 （OD值）

4 討論

雙歧桿菌和乳酸桿菌是奶牛體內(nèi)最多、最常見的生理性有益菌，發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收利用、生物屏障、免疫調(diào)節(jié)和免疫增強(qiáng)、維持腸道微生態(tài)平衡等多種生理效應(yīng)。它們的生長(zhǎng)繁殖對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高，對(duì)環(huán)境條件要求嚴(yán)格。只有同時(shí)滿足上述2 個(gè)條件，才能大量生長(zhǎng)繁殖。異麥芽低聚糖又稱分枝低聚糖，是指葡萄糖之間至少有一個(gè)以α-1-6糖苷鍵結(jié)合而成的，單糖數(shù)在2～5 個(gè)不等的一類低聚糖。低聚果糖是由蔗糖和1～3 個(gè)果糖通過β-2-1鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合而成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖及其混合物，異麥芽低聚糖和低聚果糖均為乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖因子，屬功能性低聚糖，可選擇性增殖乳酸桿菌和雙歧桿菌。這些功能性低聚糖被雙歧桿菌代謝后會(huì)產(chǎn)生醋酸及乳酸，使腸道呈酸性，抑制有害菌的增殖，促進(jìn)腸道的蠕動(dòng)。本試驗(yàn)在適宜的環(huán)境條件下，在培養(yǎng)基中添加了不同濃度的復(fù)合低聚糖，增加了雙歧桿菌和乳酸桿菌生長(zhǎng)需要的營(yíng)養(yǎng)，使之大量繁殖，抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖。

本文結(jié)果顯示，復(fù)合低聚糖對(duì)雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的作用呈現(xiàn)非常明顯的濃度效應(yīng)現(xiàn)象，但并不是越多越好，3%、5%濃度的復(fù)合低聚糖的效果基本相同，考慮到成本問題，濃度為3%的復(fù)合低聚糖較為合適。