朱傳東 綜述 鄭 勤 張全安 審校

腫瘤免疫治療的目的是針對特定的抗原激發(fā)體內(nèi)的免疫應答來消除腫瘤細胞，提高腫瘤患者的生存率以及提高生活質量。樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是目前已經(jīng)知道最強的抗原遞呈細胞。臨床研究表明，DC免疫治療誘導產(chǎn)生特定的抗原免疫應答對人體是安全的。DC在識別腫瘤細胞、刺激集體的免疫應答并同腫瘤細胞進行戰(zhàn)斗方面的優(yōu)點在免疫治療上非常突出，可以清除化療失敗的惡性腫瘤甚至是腫瘤干細胞［1］，大多數(shù)的免疫治療的體系都是通過DC來實現(xiàn)的［2，3］。因此，進行DC來源的腫瘤疫苗的研究對腫瘤的免疫治療具有重要意義。我們主要討論以DC為基礎的DC相關疫苗及其對腫瘤疾病的治療。

1 DC的細胞生物學特性

DC起源于多能造血干細胞，分為髓樣DC和淋巴樣DC 2種。DC在組織中含量極低，不足人外周血單個核細胞的1%。在組織中DC以未成熟的狀態(tài)存在，在攝取抗原后開始逐步成熟。成熟DC高表達人類DC相對特征標志CDla、MHC分子(MHC-Ⅰ和 MHC-Ⅱ)、共刺激分子(CD80、CD86)、黏附分子(CD54、CD50)及淋巴細胞功能相關抗原(CD58)。當其受到刺激被激活或成熟時，MHC Ⅰ、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40、ICAM21等免疫刺激分子和特異性抗原表達增加，抗原遞呈功能明顯增強，同時分泌一些重要的生物因子(如IL-12、TNF-α等)。此時DC向周圍淋巴組織的T細胞依賴區(qū)遷移，激活初始型T細胞，發(fā)動特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)免疫反應便具備了最初的免疫應答能力［4］。DC被認為是機體免疫應答的始動者，特別在抗腫瘤免疫中具有核心地位。未成熟DC抗原攝取能力強，但抗原提呈能力弱;成熟DC則相反。在外周淋巴器官，成熟DC表面的抗原肽-MHCⅡ類分子復合物和抗原肽-MHCⅠ類分子復合物分別被CD4、CD8T細胞表面的TCR識別，形成TCR-抗原肽-MHC分子三元體，在黏附分子及其刺激分子的作用下緊密結合，從而激活T淋巴細胞。髓樣DC主要誘導Th0向Th1分化，淋巴樣DC主要誘導Th0向Th2分化。

2 DC與腫瘤的關系

2.1 DC與腫瘤的發(fā)生及預后

研究表明，DC與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定的關系。腫瘤組織及外周DC的數(shù)量減少和功能缺陷均可導致DC不能有效遞呈腫瘤抗原、激活T淋巴細胞、誘導抗腫瘤免疫反應，致使腫瘤浸潤、轉移［5］。如果腫瘤患者體內(nèi)DC功能缺陷，不能有效遞呈抗原，則導致免疫無能或者免疫耐受，使得腫瘤發(fā)生發(fā)展［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中DC數(shù)量與腫瘤的原發(fā)病灶、轉移病灶、臨床分期及周圍浸潤呈負相關。絕大多數(shù)實體腫瘤及其周圍組織都有DC浸潤，DC高度浸潤伴腫瘤細胞高分化預后好;而腫瘤伴DC低浸潤呈惡性進展狀態(tài)。腫瘤患者體內(nèi)易發(fā)生DC的自發(fā)性凋亡以及T細胞、腫瘤細胞介導的DC凋亡［7］。具體機制目前尚不清楚，有研究表明腫瘤細胞可能是通過分泌抑制性的細胞因子、神經(jīng)節(jié)苷脂和Fas-FasL途徑［8～10］來促使DC凋亡，導致腫瘤的發(fā)生。

2.2 DC與腫瘤的免疫逃避

腫瘤細胞的免疫逃逸機制較為復雜，主要原因在于其免疫原性和具有抗原調變能力，致使腫瘤抗原不能有效提呈，T細胞介導的免疫不能被有效激活，或因缺乏共刺激信號而導致T細胞失能。針對這兩種機制，用腫瘤抗原致敏［11］或用基因修飾DC［12］甚至與腫瘤細胞融合［13］，使 DC高表達MHC Ⅰ和Ⅱ類分子提呈豐富的腫瘤抗原肽，使相應的T細胞受體被占據(jù)，同時DC提供高水平的協(xié)同刺激分子CD40/CD80/CD86等，充分激活T細胞增殖;還通過自分泌IFNA/IL6第二部分細胞因子的作用方式增強T細胞激發(fā)從而發(fā)揮抗腫瘤作用。除了產(chǎn)生強大的抗腫瘤免疫反應，DC可能也具有直接殺傷腫瘤的作用。研究發(fā)現(xiàn)DC可通過表達細胞死亡受體的配體，殺死腫瘤細胞［14］。

3 DC及DC疫苗的制備

3.1 DC 的制備

DC由CD34+或CD14+細胞中產(chǎn)生，存于人骨髓、臍血以及成年人外周血的CD34+細胞，體外在添加GM-CSF和TNF-a的培養(yǎng)條件下可以發(fā)育成熟DC;CD14+單核細胞在添加GMCSF和IL-4的條件下也可以成為成熟的DC，近期有研究發(fā)現(xiàn)LAK細胞也可以促進 DC細胞的成熟［15］。Babatz等［16］研究出了用免疫磁珠分選的方法制備CD14+細胞，從外周血分離出的單核細胞通過磁珠分選或者是plastic adherence的方法分離獲得，進而添加 IL-4，GM-CSF，TNF-a，PGE2，IL-1B 等可使 CD14+分化成單核細胞。通過這種途徑培養(yǎng)出來的DC被認為是不成熟的，它們具有高效的抗原攝取能力，同時還具備有限的刺激T細胞增殖的能力。為了提高他們的免疫原性，這些DC在正常情況下需要 TNF-a，CD40配體和單核細胞培養(yǎng)液的刺激［17］。這些激活的刺激信號誘導產(chǎn)生CD80、CD83、CD86的上調，促進親炎癥細胞因子IL-12，IL-15，TNF-α和 IL-6的分泌。PGE2刺激DC對于提高DC對MIP-3B的應答顯得尤為有效。Mip-3b是1種吸引DC遷徙至淋巴結的細胞趨化因子。循環(huán)骨髓DC細胞通常是通過密度梯度離心方法分離的。這些APC抗原提呈細胞通過體內(nèi)的FLT3配體擴增到數(shù)倍。

3.2 DC相關腫瘤疫苗的制備

目前DC疫苗主要有幾大類:細胞性腫瘤抗原修飾的DC;腫瘤抗原肽修飾的DC;腫瘤抗原及細胞因子基因轉染修飾的DC以及腫瘤細胞融合DC疫苗等。

3.2.1 細胞性腫瘤抗原修飾的DC 目前腫瘤特異性抗原或相關抗原得到明確鑒定的為數(shù)不多，因而予以瘤細胞全部抗原信息(如腫瘤細胞裂解物、腫瘤細胞提取物、腫瘤細胞的總RNA或經(jīng)過滅活的完整的腫瘤細胞、腫瘤細胞與樹突狀細胞的融合)修飾DC成為最直接的1種方法?；诩毎阅[瘤抗原易于獲取和制備，因而應用全細胞性腫瘤抗原沖擊致敏DC的方法來制備DC疫苗是目前臨床研究應用最廣泛的方法之一［18～20］。目前主要用于腎癌、惡性黑色素瘤(惡黑)、前列腺癌和惡性膠質瘤等腫瘤的臨床研究。

3.2.2 腫瘤抗原肽修飾的DC 腫瘤抗原肽 (包括合成肽)或腫瘤細胞相關抗原與自身或同種異體的DC共育，DC與腫瘤表位肽結合之后可激發(fā)抗腫瘤CTL效應，目前實驗室和臨床應用較多的抗原肽來源于眾多腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen，TAA)，包括人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)，黑色素瘤抗原，癌胚抗原(CEA)，p53，Survivin，Her-2/Neu 等［21］。確定腫瘤表達的相關TAA后，整個TAA以蛋白的形式被輸送到DC，表位抗原肽被遞呈給個Ⅱ類和Ⅰ類HLA分子，誘導出針對不同抗原來源的表位肽CTL產(chǎn)生。用負載腫瘤表位肽的DC免疫小鼠，可使具有同表位肽的腫瘤消退及抵抗致死劑量腫瘤細胞的攻擊。另外，應用腫瘤抗原MHC-Ⅰ類多肽沖擊樹突狀細胞，可提高腫瘤抗原濃度及其靶向性。

3.2.3 基因修飾制備DC疫苗 腫瘤抗原編碼基因、細胞因子基因或趨化因子基因導入DC可在期內(nèi)持續(xù)表達腫瘤抗原，增強了MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ分子遞呈抗原的能力。轉染 RNA也可以高效的誘導特異性CTL細胞的免疫應答，體外研究已在多種腫瘤上證明其有效性。轉染基因方法較多，逆轉錄病毒痘病毒介導的轉染法效率較高，基因表達比較穩(wěn)定，應用較為廣泛?；蛐揎椀腄C腫瘤疫苗既能引起高效率的CTL細胞的免疫應答，幾乎沒有副作用，是1種安全有效的免疫治療方法［15］。

3.2.4 腫瘤細胞與DC融合疫苗 細胞融合技術最大的優(yōu)點就在于融合細胞能呈遞腫瘤細胞所有的抗原，包括已知的和未知的抗原。鑒于目前大多數(shù)人類腫瘤細胞抗原類型仍未得到明確的鑒定，用全腫瘤細胞作為疫苗仍不失為一類簡單、有效的方法。最佳候選細胞為自身腫瘤細胞，DC可來源于腫瘤患者自身或者異體，融合技術目前以電融合的效率最高，通常比化學融合法提高1～2個數(shù)量級。

4 DC疫苗在腫瘤臨床治療中的應用

DC腫瘤疫苗是近年來腫瘤免疫治療領域的熱點，其基本原理是在體外誘導擴增DC，DC負載各種腫瘤相關抗原，形成疫苗回輸，從而激活針對腫瘤細胞的CTL，使患者獲得抗腫瘤的能力。目前，DC腫瘤疫苗正在被迅速、廣泛地應用于動物試驗和早期臨床試驗。無論是基礎實驗還是臨床應用，樹突狀細胞的腫瘤疫苗在腫瘤的預防和治療方面顯示了較好的應用前景。

4.1 DC與惡性黑色素瘤

DC免疫治療早期多集中于惡性黑色素瘤方面，目前取得一些可喜進展。Nagayama等［19］進行了一項DC疫苗聯(lián)合IL-2治療Ⅳ期惡性黑色素瘤的Ⅰ期臨床研究，DC疫苗制備以自體腫瘤細胞裂解物刺激外周血單個核細胞，并在細胞因子GM-CSF、IL-4和TNF-a作用下誘導成熟，10例Ⅳ期惡性黑色素瘤患者接受免疫，1×107DC，每周1次，共進行10次，同時給予IL-2，劑量為350～700 kIU，每周3次，結果證實2例有效，1例SD;在針對惡性黑色素瘤的臨床研究中，Hersey等［20，22］進行一項治療Ⅳ惡性黑色素瘤的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究，以2種不同的方法制備DC疫苗，①以自體腫瘤細胞裂解物沖擊;②MAGE-3.A2、酪氨酸激酶和gp100 3種抗原肽聯(lián)合沖擊或MART-1和KLH2種抗原肽聯(lián)合沖擊。33例患者接受治療，19組接受腫瘤細胞裂解物沖擊組治療的患者中有4例有效，14例接受抗原肽聯(lián)合沖擊組治療的患者中有9例表現(xiàn)出病情穩(wěn)定。所有患者均容易耐受，無明顯毒副作用。

4.2 DC與前列腺癌

DC相關疫苗在前列腺癌中的研究亦較為廣泛。Pandha等［18］進行Ⅰ/Ⅱ期的臨床研究中，11例激素治療失敗的前列腺癌患者和5例轉移性腎癌患者接受DC疫苗治療，結果證實該療法安全可靠，所有的患者體內(nèi)均可檢測到Th1型細胞因子明顯升高，有1例前列腺癌患者的PSA明顯降低，2例腎癌患者評價為SD。Hallmeyer等［23］亦進行了一項以PSA多肽沖擊DC制備疫苗治療前列腺癌的臨床研究，結果表明，28例受試者中有14例有檢測到遲發(fā)型變態(tài)反應的發(fā)生，其中有11例表現(xiàn)出PSA的穩(wěn)定或下降。另14例未檢測到遲發(fā)型變態(tài)反應的患者中，有9例表現(xiàn)出PSA的升高。

4.3 DC 與腎癌

Gitlitz等［24］進行了一項以DC疫苗治療轉移腎癌的臨床研究，DC疫苗通過自體腫瘤細胞裂解物沖擊外周血CD14+單個核細胞誘導成熟的DC制備，10例患者接受免疫，結果有1例患者出現(xiàn)PR。而在Avigan等［25］進行的一項DC疫苗治療轉移性腎癌Ⅰ期臨床研究中，通過自體腫瘤細胞與DC細胞融合制備疫苗，23例患者接受1×105至4 ×106融合細胞免疫，每3周1次，結果沒有治療相關不良反應的發(fā)生，分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T細胞的比例明顯升高，其中5例腎癌患者病情穩(wěn)定，提示該方法是腎癌的1種安全合理的療法。

4.4 DC與其他腫瘤

Hirschowitz等［26］進行多項DC疫苗治療非小細胞肺癌的臨床研究，其抗原肽選擇高表達Her2/neu、CEA、WT1、Mage2肺癌細胞株的凋亡小體，以其沖擊成熟DC制備疫苗，治療了16例ⅠA到ⅢB期的非小細胞肺癌患者。結果有5例患者可檢測到腫瘤特異的細胞免疫，6例患者可檢測到抗原特異的細胞免疫應答，5例患者無特異的細胞免疫產(chǎn)生。隨著一些針對非小細胞肺癌的Ⅱ期隨機臨床試驗研究的進行，DC疫苗在肺癌治療中的作用進一步凸現(xiàn)了。眾多關于DC腫瘤疫苗治療肝癌、骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌及惡性淋巴瘤等研究均進入臨床驗證階段，很多也取得令人鼓舞的結果，顯示出DC疫苗在惡性腫瘤治療中的巨大前景。

綜上所述，DC參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，無論是基礎實驗還是具體的臨床應用，基于DC的腫瘤疫苗在惡性腫瘤的預防和治療中顯示了較好的應用前景，為惡性腫瘤的免疫治療提供了新策略。但DC相關腫瘤疫苗研究存在如下不足之處:難以確定最佳刺激劑量，抗原成分復雜，可能誘發(fā)自身免疫性疾病，所用的抗原多肽不一定能誘導最佳的抗腫瘤免疫反應，刺激劑量難以確定等。關于目前的DC疫苗臨床試驗多集中于Ⅰ/Ⅱ期，距離臨床應用仍有較遠距離。對于晚期的腫瘤患者，DC疫苗幾乎不能產(chǎn)生客觀的免疫應答。人們也正在針對識別更有效的臨床免疫治療手段上作出更大的努力，比如，在提供一定的佐劑的情況下，早期接種腫瘤疫苗的效果要優(yōu)于晚期腫瘤的免疫治療。以DC為基礎的腫瘤免疫療法已經(jīng)顯現(xiàn)出臨床應用前景，是未來抗腫瘤治療的很有前景的手段之一。

［1］Jordan CT，Guzman ML，Noble M.Cancer stem cells〔J〕.N Engl J Med，2006，355(12):1253.

［2］Banchereau J，Schuler-Thurner B，Palucka AK，et al.Dendritic cells as vectors for therapy〔J〕.Cell，2001，106(3):271.

［3］Schuler G，Schuler-Thurner B，Steinman RM.The use of dendritic cells in cancer immunotherapy〔J〕.Curr Opin Immunol，2003，15(2):138.

［4］Salskov-jversen M，Berqer CL，Edelson RL.Rapid construction of a dendritic cell vaccine through physical perturbation and qpoptotic malignan T ceⅡ loading〔J〕.Immune Based Ther Vaccines，2005，3:4.

［5］Yilmaz.T，Gedikoglu G，Celik A，et al.Prognostic significance of-Langerhans cell infiltration in cancer of the laryax〔J〕.Otolaryngol-Head Neck Surg，2005，132(2):309.

［6］Nekaama Y，Inoue Y，Minagawa N.Relationships betweenS-100 protein-positive cells and clinicopatholgical factors inpatients with colorectal cancer〔J〕.Anticance Res，2003，23(6):4423.

［7］PinzonCharry A，Maxwell T，Mcguckinm A，et al.Spontaneousapoptosis of blood dendritic cells in patients with breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res，2006，8(1):R5.

［8］王興兵，劉 雋，吳競生，等.急性髓細胞性白血病細胞培養(yǎng)上清對樹突細胞分化、成熟、凋亡及功能的影響〔J〕.癌癥，2007，26(2)，142.

［9］Peguet-Navarro J，Sportouch M，Popa I，et al.Gangliosides fromhuman melanoma tumors impair dendritic cell ifferentiation frommonocytes and induce their apoptosis〔J〕.J Immunol，2003，170(7):3488.

［10］Uramoto H，Sugio K，Oyama T，et al.Expression of the p53 familyin lung cancer〔J〕.Anticancer Res，2006，26(3A):1785.

［11］Karimi K，Boudreau JE，F(xiàn)raser K，et al.Enhanced antitumorimmunity elicited by dendritic cell vaccines is a result of their ability to engage both CTL and IFN gamma-producing NK cells〔J〕.Mol Ther，2008，16(2):411.

［12］Ribas A.Genetically modified dendritic cells for cancer immunotherapy〔J〕.CWurr Gene Ther，2005，5:619.

［13］畢迎春，楊連甲，董紹忠.樹突狀細胞與腫瘤細胞融合在抗腫瘤免疫治療中的研究進展〔J〕.Medical Recapitulate，2003，9(z1):6.

［14］Hapoval AI，Tamada K，Chen L.In vitro growth inhibition of abroad spectrum of tumor cell lines by activated human dendriticcells〔J〕.Blood，2000，95(7):2346.

［15］Yano Y，Ueda Y，Itoh T，et al.A new strategy using autologous dendritic cells and lymphokine-activated killer cells for cancer immunotherapy:efficient maturation of DCs by co-culture with LAK cells in vitro〔J〕.Oncol Rep，2006，16(1):147.

［16］Babatz J，R?llig C，Oelschl?gel U，et al.Large-scale immunomagnetic selection of CD14+monocytes to generate dendritic cells for cancer immunotherapy:a phase I study.〔J〕Hematother Stem Cell Res，2003，12(5):515.

［17］Lou Y，Liu C，Kim GJ，et al.Plasmacytoid dendritic cells synergize with myeloid dendritic cells in the induction of antigenspecific antitumor immune responses〔J〕.Immunol，2007，178(3):1534.

［18］Pandha HS，Kirby RS.PC-SPES:phytotherapy for prostate cancer〔J〕.Lancet，2002，359(9325):2213.

［19］Nagayama H，Sato K，Morishita M，et al.Results of a phase I clinical study using autologous tumour lysate-pulsed monocyte-derived mature dendritic cell vaccinations for stageⅣmalignant melanoma patients combined with low dose interleukin-2〔J〕.Nagayama H，Sato K，Melanoma Res，2003，13(5):521.

［20］Hersey P，Menzies SW，Halliday GM.et al.Phase I/II study of treatment with dendritic cell vaccines in patients with disseminated melanoma〔J〕.Lett M Cancer Immunol Immunother，2004，53(2):125.

［21］Nencioni A，Grünebach F，Schmidt SM.The use of dendritic cells in cancer immunotherapy〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol，2008，65(3):191.

［22］Hersey P，Halliday GM，F(xiàn)arrelly ML，et al.Phase Ⅰ/Ⅱ study of treatment with matured dendritic cells with or without low dose IL-2 in patients with disseminated melanoma〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2008，57(7):1039.

［23］Perambakam S，Hallmeyer S，Reddy S，et al.Induction of specific T cell immunity in patients with prostate cancer by vaccination with PSA146-154 peptide〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2006，55(9):1033.

［24］Gitlitz BJ，F(xiàn)iglin RA，Kiertscher SM，J，et al.Phase I trial of granulocyte macrophage-colony stimulating factor and interleukin-4 as a combined immunotherapy for patients with cancer〔J〕.Immunother，2003，26(2):171.

［25］Avigan DE，Vasir B，George DJ，et al.Phase Ⅰ/Ⅱ study of vaccination with electrofused allogeneic dendritic cells/autologous tumorderived cells in patients with stage Ⅳ renal cell carcinoma〔J〕.J Immunother，2007，30(7):749.

［26］Hirschowitz EA，Yannelli JR.Immunotherapy for lung cancer〔J〕.Proc Am Thorac Soc，2009，6(2):224.