唐陶

（川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，四川 南充）

0 引言

末端結(jié)合蛋白1（human end-binding protein 1,EB1），由微管關(guān)聯(lián)蛋白RP/EB家族成員1（microtubuleassociated protein RP/EB family member 1,MAPRE1）基因編碼,為末端結(jié)合蛋白家族重要成員之一。EB1蛋白定位于生長中的微管末端，可以招募其他微管相關(guān)蛋白，在微管組裝和微管動態(tài)性調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著極其重要的作用，參與有絲分裂、細胞遷移、細胞形態(tài)形成等以微管為基礎(chǔ)的細胞活動。研究報道EB1在多種癌癥組織（胃癌、肝細胞癌、乳腺癌、食道鱗狀細胞癌）過表達[1]，不僅預(yù)示著腫瘤的發(fā)展及預(yù)后，也影響化療敏感性，可作為腫瘤診斷、治療、預(yù)后標(biāo)志物及治療靶標(biāo)。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對人EB1蛋白進行了結(jié)構(gòu)和功能方面的分析，為進一步研究EB1蛋白在腫瘤中的分子功能提供思路。

1 材料

分別在NCBI-gene數(shù)據(jù)庫和Uniprot數(shù)據(jù)庫中檢索人EB1基因及蛋白，其GENE ID為：22919，mRNA序列號：NM_012325.3（GI號：1519311506），EB1蛋白氨基酸序列號：NP_036457.1(GI號：6 912494；Uniprot檢索號：Q15691)。

2 方法

2.1 EB1蛋白理化性質(zhì)分析

利用ORFfinder查找人EB1開放閱讀框。在ProtParam數(shù)據(jù)庫（https://web.expasy.org/protparam/）分析EB1蛋白分子量、酸堿性和不穩(wěn)定指數(shù)等理化性質(zhì)。利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）在線工具分析EB1蛋白的親水性和疏水性（window size為15）。

2.2 EB1信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化修飾位點及亞細胞定位分析

分別利用SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）、TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、NetPhos 3.1 server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測EB1信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)及磷酸化位點。在genecards (https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫查詢EB1亞細胞定位。

2.3 EB1蛋白結(jié)構(gòu)分析

使用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)在線工具預(yù)測EB1蛋白二級結(jié)構(gòu)。在pfam(http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫分析EB1蛋白結(jié)構(gòu)域。SWISSMODEL(https://swissmodel.expasy.org/)同源建模法預(yù)測EB1蛋白三維結(jié)構(gòu)。

2.4 EB1蛋白互作

通過string網(wǎng)站預(yù)測EB1互作蛋白，置信度設(shè)置為0.7。在reactome數(shù)據(jù)庫查詢EB1參與信號通路。

2.5 EB1在腫瘤中的表達及生存分析

在Gene Expression Display Server查詢EB1/MAPRE1在各種腫瘤中的表達水平。利用Kaplan-Meier Plotter繪制生存曲線。

3 結(jié)果

3.1 EB1的理化性質(zhì)

EB1的mRNA序列得到的ORF共21個，最長的為ORF1，共807bp，編碼268個氨基酸。ORF1編碼序列與EB1氨基酸序列一致。EB1蛋白分子量為29999.08，蛋白質(zhì)的總分子式為C1340H2099N355O408S9,原子總數(shù)為4211。含有268個氨基酸殘基，帶負電荷的殘基總數(shù)為（Asp+Glu）39個，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）31個。理論等電點為5.02,說明蛋白偏酸性。EB1蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為35.16，為穩(wěn)定型蛋白。EB1蛋白的脂肪指數(shù)為81.16，親水性的平均值為-0.427，說明該蛋白為親水性蛋白。ProtScale分析結(jié)果為EB1蛋白疏水性評分最高為1.1，親水性評分最高為-1.8。EB1蛋白親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，表明EB1蛋白屬于親水性蛋白。

3.2 EB1信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化修飾位點及亞細胞定位

SignalP4.1、TMHMM分析結(jié)果顯示EB1不存在信號肽和跨膜區(qū)。NetPhos 3.1預(yù)測EB1蛋白磷酸化位點較多，以得分>0.7計，分別為16/155/156/165位的絲氨酸、71/124/268位的酪氨酸和166位的蘇氨酸。genecards顯示EB1主要定位在細胞骨架、細胞質(zhì)，置信度評分為5。

3.3 EB1蛋白結(jié)構(gòu)

EB1蛋白二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)卷曲和α螺旋占比最高，分別為133個（49.6%）、128個（47.8%）。pfam數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示MAPRE1蛋白有2個結(jié)構(gòu)域，分別是位于N端的鈣調(diào)蛋白同源（calmodulin homology，CH）結(jié)構(gòu)域及C端的末端結(jié)合蛋白同源（EBH）結(jié)構(gòu)域。CH結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)MAPRE1與微管相互作用。EBH結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)MAPRE1與含有SxIP序列的微管相關(guān)蛋白如APC、ACF7/MACF1、CLASP1/2相互作用。SWISS-MODEL軟件得到1個EB1三維結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)模型，該模型與模板1vka.1.A序列相似性100%，該蛋白無配體。

3.4 EB1蛋白互作

String蛋白互作分析按得分>0.9者，共得到10個EB1互作蛋白：MAPRE3、CKAP5、DCTN1、CLIP1、DST、AKAP9、AURKA、AURKB、KIF2C、TUBB。Reactome數(shù)據(jù)庫顯示EB1參與6種信號通路，包括細胞周期檢測點、有絲分裂間期/前中期/中后期、Rho GTPases通路和Cilium Assembly通路。

3.5EB1在腫瘤中的表達及生存分析

GEDs數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示EB1在直腸腺癌（rectum adenocarcinoma,READ）、多形性膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）、結(jié)腸腺癌（colon adenocarcinoma,COAD）、肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC）、乳腺浸潤癌（breast invasive carcinoma,BRCA）、食管癌（esophageal carcinoma,ESCA）、胃腺癌（stomach adenocarcinoma,STAD）、肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）、膽管癌（cholangiocarcinoma,CHOL）、肝細胞癌（liver hepatocellular carcinoma,LIHC）中高表達；但在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)、甲狀腺癌（thyroid carcinoma，THCA）等腫瘤中低表達或表達差異不明顯。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫顯示，EB1/MAPRE1高表達乳腺癌、肺癌、胃癌及卵巢癌患者生存率較低表達患者明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

4 討論

本研究依托生物信息學(xué)分析人EB1蛋白，預(yù)測EB1蛋白是偏酸性穩(wěn)定型親水性蛋白。EB1蛋白互作蛋白中，MAPRE3編碼末端結(jié)合蛋白3，該蛋白也是末端結(jié)合蛋白家族成員之一，在腦、骨骼肌中高表達，其N端與微管末端相互作用，C端可與APC（adenomatous polyposis coli）同源物APCL相互結(jié)合。作為微管末端結(jié)合蛋白，EB3定位于微管正極端抑制微管解聚以穩(wěn)定微管，參與軸突生長和細胞間黏附等生物過程[2]。Kim[3]發(fā)現(xiàn)高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性胃癌及結(jié)腸癌發(fā)生MAPRE3基因框移突變（p.Cys182AlafsX31;p.Cys182LeufsX16）頻率顯著高于低高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）,但進一步分析發(fā)現(xiàn)突變的出現(xiàn)與組織學(xué)分級、臨床分期、轉(zhuǎn)移及生存期無明顯關(guān)系。目前關(guān)于MAPRE3的報道主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域，關(guān)于MAPRE3與腫瘤發(fā)生發(fā)展機制關(guān)系還待進一步研究。細胞骨架相關(guān)蛋白5（cytoskeleton—associated protein 5，CKAP5),由ch-TOG基因編碼，是含有TOG或TOG樣結(jié)構(gòu)域微管末端示蹤蛋白代表成員之一，但它和EB1蛋白具有不同的微管結(jié)合模式。CKAP5可穩(wěn)定紡錘體微管并可調(diào)節(jié)中心體微管，促進雙極紡錘體的形成。CKAP5的異常表達使中心體微管聚合物顯著減少，導(dǎo)致多極紡錘體形成，促進癌癥的發(fā)展[4]。據(jù)報道，CKAP5表達在結(jié)腸和肝臟腫瘤較正常組織顯著增加。Yu等[5]研究也發(fā)現(xiàn)CKAP5在肝細胞肝癌中相較于癌旁組織表達明顯增加，且高表達預(yù)示著降低的總生存期。DCTN1編碼p150glued蛋白，該蛋白可通過N端的CAP-Gly結(jié)構(gòu)域與EB1、EB3結(jié)合，參與有絲分裂、紡錘體形成、細胞核定位、胞內(nèi)大分子的運輸和定位等多種生物進程。DCTN1與脊髓側(cè)索硬化癥、遠端運動神經(jīng)病變VII B型、佩里綜合征的發(fā)病有關(guān)[6]。CLIP1蛋白N端可與EB1相互作用從而使其定位在微管正末端，C端結(jié)構(gòu)可與P150glued蛋白直接結(jié)合，與有絲分裂等細胞功能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)CLIP1無義突變可能導(dǎo)致智力缺陷的發(fā)生，這可能是因為CLIP1參與神經(jīng)元發(fā)育有關(guān)[7]。AKAP9編碼的AKAP350和AKAP450主要定位于中心體，與微管組裝及介導(dǎo)的運動有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)AKAP9基因突變與胃癌、直腸癌等多種癌癥發(fā)病有關(guān)[8]。Aurora蛋白激酶包含AURKA、AURKB及Aurora-C,這三種Aurora蛋白激酶相互結(jié)合，在細胞有絲分裂和減數(shù)分裂生物過程中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)AURKA、AURKB在多種癌癥如乳腺癌中高表達，且與預(yù)后不良相關(guān)[9]。

Dong等[10]發(fā)現(xiàn)，EB1在乳腺癌組織呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，同時觀察到EB1表達水平與乳腺癌患者組織學(xué)分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，且影響乳腺癌對紫杉醇化療敏感性。研究發(fā)現(xiàn)EB1在肺癌組織中高表達，EB1陽性肺癌患者總生存期和3年生存率均顯著低于EB1陰性肺癌患者[11]。研究發(fā)現(xiàn)EB1和AURKB在卵巢癌中陽性表達率顯著高于卵巢正常組織，EB1、AURKB陽性表達者卵巢癌患者總生存率明顯縮短[12]。上述研究與本文GEDs、Kaplan-MeiMer plotter數(shù)據(jù)庫結(jié)果一致。

綜上所述，本文通過生物信息學(xué)分析人EB1蛋白結(jié)構(gòu)、功能，發(fā)現(xiàn)EB1參與腫瘤發(fā)生發(fā)展預(yù)后過程，但由于EB1信號傳導(dǎo)極其復(fù)雜，參與多條信號通路，了解EB1蛋白分子結(jié)構(gòu)，為研究其與腫瘤發(fā)展的許多潛在機制提供新思路。