趙宗保，胡翠敏

1 中國科學院大連化學物理研究所，大連 116023

2 大連潔凈能源國家實驗室 (籌)，大連 116023

3 中國科學院研究生院，北京 100049

能源微生物油脂技術進展

趙宗保1,2，胡翠敏1,3

1 中國科學院大連化學物理研究所，大連 116023

2 大連潔凈能源國家實驗室 (籌)，大連 116023

3 中國科學院研究生院，北京 100049

微生物油脂技術是緩解生物柴油規(guī)?；a原料短缺的有效途徑之一。介紹了國內外利用產油真菌生產能源微生物油脂的現狀，包括拓展發(fā)酵原料、選育優(yōu)良菌株、建立新型調控策略和不同培養(yǎng)模式以及解析油脂過量積累的分子機制；概括了微生物油脂技術產業(yè)化面臨的問題及其解決方案；最后指出了能源微生物油脂研究未來發(fā)展方向。

微生物油脂，生物柴油，木質纖維素，發(fā)酵，合成生物學，生物煉制，生物能源

Abstract:Microbial lipid is a potential raw material for biofuel industry. In this review, we summarized recent progress in microbial lipid production by oleaginous fungi in terms of identifying cheap feedstock, developing robust lipid producer, establishing novel strategies and better culture modes for cellular lipid accumulation, as well as revealing the molecular mechanism of oleaginity.We discussed issues, solutions and directions for further development of microbial lipid technology.

Keywords:microbial lipid, biodiesel, lignocellulose, fermentation, synthetic biology, biorefinery, biofuel

當今世界面臨化石資源枯竭和自然環(huán)境惡化的全球性挑戰(zhàn)。對于我國，一方面近年來石油進口依存度已威脅到國家能源和經濟安全，另一方面過度消耗化石燃料帶來的環(huán)境問題已成為限制社會經濟可持續(xù)發(fā)展的重要因素。發(fā)展可再生能源技術，減少化石資源消耗，受到廣泛關注。生物柴油是性能優(yōu)良、可直接替代化石柴油的生物燃料產品，其主要化學成分是長鏈脂肪酸 (甲) 酯。目前生物柴油生產以動植物油脂為原料，原料成本占總生產成本的70%以上。大豆油、菜籽油、棕櫚油等植物油脂是部分國家生產生物柴油的主要原料。然而，植物油脂長期以來主要是用于滿足食用和為油脂化工行業(yè)提供原料。據統(tǒng)計，世界植物油年產量只有約1.4億 t，其資源總量顯然不適應規(guī)?；锶剂仙a。因此，亟需發(fā)展新型油脂生產技術，以促進生物柴油產業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

通過代謝過程將碳水化合物等有機物轉化為油脂，是細胞必需的生物學過程之一。少數微生物可在胞內合成和貯存超過細胞干重20%的油脂，具有該表型的微生物稱為產油微生物[1]。雖然細菌、酵母、霉菌和藻類中都有產油菌株，但以酵母和霉菌類真核產油微生物積累的油脂具有與常規(guī)植物油更相近的脂肪酸，也就是說更適合作為生物柴油生產原料。因此，本文僅限于討論產油酵母和產油霉菌。與種植油料植物相比，利用微生物生產油脂具有以下突出特點：周期短、可連續(xù)生產、可規(guī)?；米匀唤缲S富的碳水化合物資源。早期關于微生物油脂的研究主要是為了解決食用油匱乏的問題，但生產成本高于動、植物來源的油脂。后來，有關微生物油脂的探索集中在獲取功能性油脂，如富含多不飽和脂肪酸的油脂[2]。限于篇幅，本文將不討論早期以及側重于高附加值油脂的研究。近來人們意識到通過微生物生產油脂及相關脂肪酸代謝衍生物，對生物柴油產業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生物質資源利用具有重要意義[3]。本文將總結能源油脂發(fā)酵相關研究的最新進展并探討存在的問題和未來發(fā)展方向。

1 能源微生物油脂技術的原料與菌株

葡萄糖通常是微生物生長的最適碳源，以葡萄糖作為碳源培養(yǎng)產油微生物的研究很多，菌體油脂含量可達到60%以上，取得了很好的結果[4-5]。但利用葡萄糖及淀粉質原料大規(guī)模進行能源油脂生產，難免會造成“與人爭糧，與糧爭地”的局面，產生一系列社會經濟問題。而且，淀粉質原料成本高。因此，面向生物燃料的油脂發(fā)酵技術需要特別關注其他大宗原材料，如農林廢棄物 (各種作物秸稈) 和非糧糖質原料 (如菊芋、木薯等) 的水解液和工業(yè)廢棄物中的有機質。值得注意的是，相對于傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)成分比較明確的原料，上述原料可以稱之為“粗原料”?！按衷稀背刑妓衔镆酝?，還含有大量非糖、甚至非有機質成分，它們對微生物生長、代謝和產物生成的影響非常復雜。因此，利用“粗原料”進行生物化學轉化要求菌株底物利用譜寬、綜合抗逆性高、產物轉化率高。

1.1 利用木質纖維素原料生產油脂

木質纖維素原料主要由纖維素、半纖維素和木素三部分組成。經過一定的物理/化學處理，木質纖維素可以轉化為含有單糖的原料 (水解液)，用于微生物培養(yǎng)。木質纖維素水解液具有 2個特別突出的特點：含有水解副產物；六碳糖和五碳糖共存。木質纖維素水解產生的副產物有糠醛、羥甲基糠醛、乙酸、酚類物質等，它們影響微生物生長和代謝。因此，需要篩選抗逆性好的產油菌株。華東理工大學鮑杰等考察了各種副產物對不同產油酵母的毒性，表明乙酸、甲酸、糠醛、香草醛對產油微生物均有較強抑制作用[6]。本實驗室考察了培養(yǎng)基中單一或多種水解副產物存在下，圓紅冬孢酵母 Rhodosporidium toruloides油脂發(fā)酵的行為，發(fā)現1 mmol/L糠醛可顯著抑制該酵母菌生長和油脂積累[7]。值得特別指出的是，當培養(yǎng)基中多種水解副產物并存時，毒性沒有呈現簡單的累加特征，說明水解副產物對微生物的影響非常復雜。目前已經有利用木質纖維素水解液發(fā)酵產油脂的報道，說明一些產油菌株具有較好的抗逆性。南京師范大學戴傳超等從玫瑰花樣品中篩選出一株具有木糖同化能力的粘紅酵母Rhodotorula glutinis，將其在樹葉水解液中培養(yǎng)，能夠獲得油脂含量為29%的菌體[8]。華南理工大學宗敏華等利用經過脫毒處理的稻草水解液培養(yǎng)發(fā)酵性絲孢酵母 Trichosporon fermentans，8 d后菌體油脂含量達到40%[9]。青島生物能源與過程研究所咸漠等考察了混濁紅球菌Rhodococcus opacus在經過離子液體預處理和酶處理的玉米芯水解液中的產油情況，結果表明該菌株利用水解液的效率與葡萄糖相當[10]。將來可通過誘變或者進化工程的策略進一步提高菌株耐受水解副產物的能力，從而更有效地利用木質纖維素水解液生產油脂。

雖然依據水解工藝條件差異，木質纖維素水解液中各單糖相對含量有差異，但水解液中通常含有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖[11]。水解液六碳糖和五碳糖共存的原料特征，對生物化學轉化提出了挑戰(zhàn)。這是因為微生物往往優(yōu)先利用葡萄糖，然后再利用木糖；有的微生物甚至難以利用木糖或前述其他幾種出現在水解液中的單糖。如果微生物對單糖底物存在明顯的偏好性或專一性，以水解液為原料進行生物轉化時就會有發(fā)酵周期長、底物利用率低、產物得率低、廢水處理成本高等一系列問題。本實驗室的早期研究篩選了11株產油酵母的碳源利用能力，發(fā)現所有實驗菌株都能利用多種單糖，包括葡萄糖和木糖[12]。通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件，以葡萄糖和木糖為碳源培養(yǎng)斯達氏油脂酵母Lipomyces starkeyi，混合糖利用率、菌體油脂含量和油脂得率分別達99%、52%和14%[13]。雖然多數產油微生物具備代謝五碳糖和六碳糖的能力，也能夠轉化天然原料水解產物為胞內油脂，但當多種碳源并存時，其他碳源的利用會受到葡萄糖抑制，也就是所謂的葡萄糖效應。葡萄糖效應導致底物利用出現明顯延滯期，發(fā)酵周期延長，降低整個發(fā)酵過程的經濟性。所以，開發(fā)能夠同步利用五碳糖和六碳糖的菌株，對木質纖維素原料生物轉化至關重要。本實驗室經過篩選，發(fā)現皮狀絲孢酵母T. cutaneum能夠同步轉化葡萄糖和木糖，底物利用和產物積累都沒有出現延滯期，并且混合糖發(fā)酵時間與同等濃度單糖發(fā)酵時間相當，提高了混合糖發(fā)酵效率 (待發(fā)表)。

1.2 利用甲殼素類生物質和菊芋等高糖植物生產油脂

甲殼素又稱幾丁質，主要存在于節(jié)肢動物 (如蝦、蟹等) 和軟體動物中，是自然界中含量僅次于纖維素的一種多糖，也是地球上儲量最豐富的含氮有機化合物。甲殼素水解得到的 N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc) 和氨基葡萄糖，可能是生物轉化制備燃料和生物基化學品的重要潛在原料。本實驗室篩選發(fā)現，多株產油酵母包括白色隱球酵母 Cryptococcus albidus、彎曲隱球酵母 C. curvatus、T. fermentans和T. cutaneum能轉化GlcNAc為油脂，積累在細胞內，菌體油脂含量達到40%以上[14]。通過發(fā)酵條件優(yōu)化，C. curvatus菌體油脂含量和油脂得率分別達到54%和 16%[15]。

菊芋是一種耐貧瘠、耐寒、耐旱的多年生高產、高糖植物，可在沿海灘涂地、鹽堿地種植，不額外占用耕地。菊芋中主要成分為低聚果糖，較易水解為單糖。本實驗室以去皮菊芋為原料，通過酸處理得到菊芋汁，用于培養(yǎng)R. toruloides，總糖利用率高達95%，細胞油脂含量達到40%[16]。在15 L發(fā)酵罐中，采用重復補料方式補充菊芋水解液，最終油脂含量提高到57%[17]。中國海洋大學池振明等將菊粉酶基因導入亞羅解脂酵母Yarrowia lipolytica，利用菊粉和菊芋提取物生產微生物油脂，菌體油脂含量分別達到48%和50%[18]。以菊芋為原料生產微生物油脂，不僅能夠部分解決原料來源問題，同時也可有效地解決灘涂、鹽堿地荒置問題。

1.3 利用工業(yè)有機廢棄物生產油脂

產油微生物底物譜廣泛，除了能夠利用以上碳源外，還能夠將工業(yè)有機廢棄物轉化成油脂。廢糖蜜作為制糖工業(yè)副產物，是一種富含碳水化合物的廢棄資源。宗敏華等以廢糖蜜為主要原料，培養(yǎng)T. fermentans，菌體油脂含量達到 62%[5]。土耳其學者 Donmez等以糖蜜為原料培養(yǎng)解脂假絲酵母Candida lipolytica、熱帶假絲酵母 C. tropicalis和粘性紅圓酵母R. mucilaginosa，菌體油脂分別達到60%，46%和69%[19]。上述結果說明，廢糖蜜可以作為油脂發(fā)酵的原料。粗甘油是生物柴油工業(yè)的副產物，由于其純化過程成本高，通常作為工業(yè)廢料對待。美國南伊利諾大學梁燕娜等利用粗甘油培養(yǎng) C. curvatus，菌體油脂含量達到52%[20]。北京化工大學譚天偉等探索利用工業(yè)廢水生產油脂。以味精生產廢水為原料培養(yǎng)R. glutinis時，由于其C/N (mol/mol) 比太低，不適合積累油脂，菌體油脂含量在10%左右，但補加碳源提高廢水C/N比后，菌體油脂含量提高到20%，COD降解率為45%[21]。在300 L發(fā)酵罐規(guī)模下，利用淀粉廢水培養(yǎng)R. glutinis，發(fā)酵30~40 h生物量達到40 g/L，菌體油脂含量35%，COD降解率達80%[22]。利用工業(yè)廢棄物生產油脂不僅可以為生物柴油提供原料，同時也對環(huán)境治理具有重要意義。

2 油脂發(fā)酵調控策略新進展

由于當前對產油微生物遺傳背景的認識非常有限，尚難以進行分子靶向性調控油脂積累代謝。因此，關于產油微生物發(fā)酵調控主要依賴生物化學工程方法，即通過控制培養(yǎng)基營養(yǎng)可得性及環(huán)境條件來促進油脂生物合成，這也是發(fā)酵工程中最通用的策略。

2.1 培養(yǎng)基營養(yǎng)限制調控油脂積累

當前認為產油微生物在氮限制條件下油脂過量積累。培養(yǎng)基中氮源耗盡，腺苷酸 (AMP) 脫氨酶活性增加，AMP大量轉化為肌苷酸和氨，線粒體中 AMP-依賴型異檸檬酸脫氫酶活性抑制，三羧酸循環(huán)低迷，導致檸檬酸積累，并被轉運到胞漿中，生成乙酰-CoA，然后在脂肪酸合成酶的作用下合成脂肪酰-CoA，并最終生成脂肪酸甘油脂[23]。因此，油脂發(fā)酵中最常用的調控策略是改變培養(yǎng)基的氮元素供給，即改變培養(yǎng)基C/N比。本實驗室研究了C/N比對R. toruloides油脂含量的影響，表明油脂含量隨C/N比增大而提高，經過優(yōu)化，C/N比為420時，油脂含量達到 76%[4]。希臘學者 Papanikolaou等考察多種營養(yǎng)元素限制培養(yǎng)基中刺孢小克銀漢霉Cunninghamella echinulata和深黃被孢霉Mortierella isabellina油脂積累時發(fā)現，培養(yǎng)基中C/N比從83.5增加到133.5時，C. echinulata和M. isabellina的油脂含量分別從36%和50%提高到47%和56%[24]。同時Papanikolaou等還研究了高糖濃度下M. isabellina油脂積累，固定培養(yǎng)基中氮源濃度，改變初始葡萄糖濃度來改變培養(yǎng)基初始C/N比，當培養(yǎng)基初始C/N比在150~340時，菌體油脂含量在50%~55%之間[25]。

雖然不如氮限制策略使用廣泛，磷限制在油脂發(fā)酵中也有報道。本實驗室在優(yōu)化R. toruloides發(fā)酵條件時發(fā)現，降低 KH2PO4濃度能顯著提高菌體油脂含量[4]。通過考察不同 C/P比對該酵母產油的影響，表明磷限制也是一種非常有效的油脂積累調控策略。在培養(yǎng)基初始C/N比為22時，將初始C/P比由72提高到9 552，油脂含量由21%提高到62%[26]。此外，對硫限制的初步探索也獲得了類似結論。培養(yǎng)基初始C/N比為28，將初始C/S比由150提高到46 750，油脂含量則由20%提高到58%[27]。磷和硫是合成核酸、蛋白質和輔酶的必需元素，這兩種元素的缺乏可導致細胞增殖受抑制，但脂肪酸及油脂合成代謝仍然比較活躍，所以導致胞內油脂積累。

非氮限制調控策略對利用氮含量豐富的天然原料或廢棄物等“粗原料”生產油脂具有重要意義。前面提到的菊芋汁、甲殼素水解產物和味精廢水等，總氮含量比較高，直接用于培養(yǎng)產油微生物，往往菌體油脂含量不高。如果采用適當的技術脫除磷源，提高原料的 C/P比，可以使底物更有效地轉化為油脂[28]。

2.2 小分子調控油脂積累

除了不同營養(yǎng)限制因素能夠促進油脂積累以外，近年來也有一些關于小分子調控產油微生物的報道。日本學者 Kimura等考察了多種香料成分對L. starkeyi產油能力的影響，表明濃度為20 mg/L的茴香腦、松油醇、乙酰苯等能使產油微生物生長或油脂積累提高10%~46%[29]。希臘學者Papanikolaou等發(fā)現甜橙精油對Y. lipolytica生長和產油有影響。增加培養(yǎng)基中精油添加量，酵母生物量大幅度降低，產物中飽和脂肪酸含量增加[30]。本實驗室考察了真菌群體感應分子色醇對L. starkeyi產油能力的影響。接種培養(yǎng)36 h后向培養(yǎng)基添加100 μmol/L色醇，生物量、油脂量和油脂得率系數分別增加7.4%、13.9%和14.2%，并且發(fā)酵時間縮短13.3%[31]。由此可見，通過在產油發(fā)酵過程中使用某些小分子化合物，可能達到提高油脂生產效率，甚至調節(jié)產物中脂肪酸相對含量的效果。小分子調控油脂積累不僅簡單易行，而且對于研究產油微生物油脂代謝調控的分子基礎具有重要價值。

2.3 應用不同發(fā)酵模式調控油脂發(fā)酵

通常利用微生物生產胞內產物，可以采用的培養(yǎng)方式有3種：批式培養(yǎng)、補料-批式培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。文獻中產油微生物的培養(yǎng)方式主要是批式培養(yǎng)。在批式培養(yǎng)過程中，由于菌體生長受到培養(yǎng)基中營養(yǎng)物初始濃度限制，當菌體生長到一定濃度時，培養(yǎng)基中一種或幾種營養(yǎng)物質濃度成為細胞增殖的限制因素。簡單地提高限制性營養(yǎng)物質的初始濃度，不一定能提高生長量；相反高濃度營養(yǎng)物質還可對細胞產生毒害作用。因此，采用批式培養(yǎng)很難獲得很高的產物濃度和生產強度。梁燕娜等以粗甘油為碳源培養(yǎng)C. curvatus生產油脂，在批式培養(yǎng)條件下，甘油濃度為20 g/L時生物量約為6 g/L，提高甘油濃度至40 g/L時，菌體生長受到明顯抑制；而在補料-批式培養(yǎng)條件下，初始甘油濃度為30 g/L左右，經過多次補料，生物量最終達到30 g/L以上，菌體密度明顯提高[20]。本實驗室采取三種補料-批式培養(yǎng)方式提高R. toruloides油脂發(fā)酵的生產強度。首先采取間歇補料方式，即在培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低于5 g/L時補加高濃度糖溶液至50 g/L，在144 h內重復5次補料，最終油脂生產強度為0.36 g/(L·h)；其次采取連續(xù)流加的補料方式，將葡萄糖濃度控制在5 g/L，相同時間內油脂生產強度提高到0.57 g/(L·h)；最后采取重復-補料-批式培養(yǎng)的方式，培養(yǎng)358 h，平均油脂生產強度為0.55 g/(L·h)[32]。此外，為縮短發(fā)酵時間，減少原料消耗，本實驗室還提出了細胞增殖和油脂積累分離的兩階段培養(yǎng)模式，用于制備微生物油脂。將增殖階段獲得的R. toruloides細胞直接重懸接種于葡萄糖水溶液中，通氣培養(yǎng)，發(fā)現菌體內快速積累油脂，最終油脂含量超過55%[33]。兩階段培養(yǎng)模式可節(jié)省氮源及其他輔料，減少油脂發(fā)酵生產廢水排放；并且由于油脂積累階段幾乎無細胞增殖，碳源全部用于生產油脂，產物得率高。

除液態(tài)發(fā)酵模式以外，近年來有一些工作探索了將固態(tài)發(fā)酵模式應用于獲取微生物油脂。中國科學院過程工程研究所陳洪章等用經汽爆預處理的麥稈為原料，接種培養(yǎng)一種可分泌纖維素酶的植物內生真菌，油脂得率為42 mg/g干物質[34]。浙江大學趙宇華等利用米曲霉Aspergillus oryzae轉化麥稈生產微生物油脂，在優(yōu)化條件下油脂得率為 62 mg/g干物質[35]。希臘學者 Vayenas等開發(fā)了一種半固態(tài)培養(yǎng)模式，利用M. isabellina轉化甜高粱為微生物油脂。當培養(yǎng)體系中水含量為92%時，油脂得率為110 mg/g 干物質[36]。

3 產油真菌油脂積累機制研究進展

對于產油微生物，尤其是產油酵母的油脂過量積累機制，當前還主要停留在生化水平上，詳細內容可以參考最新的文獻[23,37]。一般認為，產油酵母線粒體中的異檸檬酸脫氫酶 (ICDH) 受到 AMP的變構調節(jié)。當胞內氮源匱乏時，AMP在脫氨酶作用下轉化為肌苷酸和氨，導致線粒體中檸檬酸積累，并被轉運到胞漿中。產油酵母中含有ATP-檸檬酸裂解酶 (ACL)，可以將檸檬酸裂解為乙酰CoA和草酰乙酸，并進一步在脂肪酸合酶 (FAS) 作用下完成脂肪酰 CoA和油脂合成。值得注意的是，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因組不含有編碼ACL的基因，進一步表明油脂過量積累的表型具有特定的代謝基礎。然而在產油真菌卷枝毛霉 Mucor circinelloides 和高山被孢霉M. alpina中ICDH的體外活性并不完全依賴于 AMP[38]。ACL催化反應的另一產物草酰乙酸經蘋果酸脫氫酶還原成蘋果酸，再在蘋果酸脫氫酶 (ME) 作用下氧化脫羧得到丙酮酸，并釋放NADPH。研究表明，產油微生物油脂積累與ME代謝調控有關：ME受到抑制，則油脂積累下降。這是因為雖然代謝網絡中有許多可生成NADPH反應，但脂肪酸合成碳鏈延伸反應所需的NADPH幾乎完全來源于 ME催化的反應[39]。在M. circinelloides中過表達編碼ME的基因，發(fā)現油脂積累量提高2.5倍[40]。但是，由于FAS生成每個2 碳單元 (?CH2CH2?) 需要消耗 2 分子 NADPH，而ACL活性在生成1分子2碳單元合成前體乙酰CoA時只能最終得到1分子NADPH。因此，從化學計量關系分析，脂肪酸合成還需要其他途徑供給還原當量。由于脂肪酸和油脂是還原度很低的代謝產物，生物合成需要消耗大量還原當量。目前人們對產油微生物中還原當量供給途徑還缺乏清晰了解。

本實驗室最近克隆了產油酵母 L. starkeyi編碼IDH的基因，通過熒光定量 PCR技術在轉錄水平驗證了 IDH活性與胞內油脂積累的關系[41]。分離、鑒定了產油酵母R. toruloides編碼IDH的基因，通過S. cerevisiae基因替換實驗發(fā)現，異源表達R. toruloides的IDH活力受培養(yǎng)環(huán)境C/N比調控，并與胞內油脂含量密切相關[42]。另外，分離得到了來源于L. starkeyi一個ME基因，并且研究了相應重組蛋白的生化性質[43]。

對產油微生物的組學研究仍處于初始階段。Y. lipolytica CLIB122是目前已經完成全基因組測序的產油酵母，其基因組大小為 20 Mb，其單倍體菌株含有6條染色體[44]。但相對于其他高產油酵母，當以碳水化合物為碳源時，Y. lipolytica胞內油脂含量通常低于 20%，因此并非真正意義上的產油酵母。美國能源部Joint Genome Institute已經完成L. starkeyi NRRL Y11557的全基因組草圖，相信不久即可為產油機制研究提供大量新信息。Athenstaedt等應用蛋白質組學方法研究了Y. lipolytica ATCC 20460胞內脂肪粒 (Lipid particle) 相關的蛋白質，發(fā)現碳源和培養(yǎng)條件對脂肪粒的蛋白質和脂肪化學組成具有明顯影響[45]。本實驗室開展了油脂發(fā)酵過程差異蛋白質組學研究。利用限氮培養(yǎng)誘導 R. toruloides和L. starkeyi油脂積累，通過二維液相色譜/串聯質譜技術分析不同培養(yǎng)階段細胞的蛋白質組，進行比較及半定量蛋白質組學分析。從R. toruloides樣品中鑒定出114種差異表達的蛋白質，其中46種蛋白質在油脂合成過程中表達水平有顯著變化[46]。從L. starkeyi樣品中鑒定出289種差異表達的蛋白質，其中81種蛋白質在油脂合成過程中表達水平有顯著變化[47]。這些結果不僅說明了培養(yǎng)環(huán)境氮源匱乏對油脂積累代謝的影響，而且為深入探討胞內油脂代謝的機制和理性改造產油微生物提供了重要信息。

總之，當前產油真菌的遺傳背景信息非常有限，分子操作技術不成熟，導致揭示油脂過量積累的分子機制和菌株改造研究進展緩慢。

4 能源微生物油脂技術存在的問題和展望

發(fā)酵法生產油脂，具有周期短、可連續(xù)運行、原料豐富、生產潛力大等突出優(yōu)點。利用單糖為原料，目前油脂發(fā)酵已達到較高水平，如菌體密度達到151 g/L，油脂產量72 g/L[48]。但是，規(guī)?；a微生物油脂，尚面臨一些問題。首先是發(fā)酵原料問題。由于采用單糖或淀粉質原料生產油脂不僅成本高，而且原料供給總量難以保障。因此，能源油脂發(fā)酵必須使用其他非糧原料，包括木質纖維素原料、工業(yè)有機廢棄物等?？傮w上，木質纖維素資源處理成可發(fā)酵原料的技術還不成熟。針對原料問題，需要特別關注產油菌株的原料適應性和抗逆性。在未來的工作中，應研究復雜原料條件下產油微生物生長代謝規(guī)律，建立與油脂發(fā)酵相匹配的原料處理方法，改造產油菌株的底物利用能力。能源油脂發(fā)酵還面臨新的生物化學工程問題。油脂是微生物的胞內產物，尚不能自然分泌到胞外，必須經過分離提取工藝才能從發(fā)酵醪液回收得到。在進行高密度油脂發(fā)酵時，氧傳遞等工程問題非常明顯。因此，通過傳統(tǒng)誘變手段或現代分子生物學手段，創(chuàng)建分泌包括油脂在內脂肪酸代謝衍生物的菌株，對簡化產物分離、提高得率、實現能源油脂的連續(xù)生產具有重大意義。如果單從生物柴油制備技術看，直接利用產油微生物干菌體進行甲酯化制備生物柴油，省去了油脂提取步驟，也可能降低生物柴油總生產成本[49]。

成本高是能源微生物油脂生產的制約因素之一。但是，目前還較少考慮能源微生物油脂伴生產物的價值。按照生物煉制和綠色化學理念，原料經油脂發(fā)酵轉化后得到的物質需要進一步以“吃干榨盡”的方式轉化為多種產品。例如，可開發(fā)利用油脂提取剩余物，從中分離得到高值化產品；也可以從微生物油脂中分離高值化產品。常見的產油紅酵母，可同時產生類胡蘿卜素、甾醇、脂肪酶等產品，值得進行深入研究。另外，應用合成生物學理念構建生產包括油脂在內的脂肪酸代謝衍生物的菌株，設計產物的化學結構和組成，也可能顯著改善技術經濟性。例如，通過對大腸桿菌Escherichia coli基因組進行改造，獲得了以葡萄糖為碳源合成脂肪酸的工程菌株，在批式培養(yǎng)條件下脂肪酸濃度達到2.5 g/L[50]。通過對E. coli脂肪酸代謝途徑進行系統(tǒng)再設計，通過敲除產物降解基因、過表達內源基因、敲入具有新功能的外源基因等手段，得到一系列可利用葡萄糖為碳源過量生產脂肪酸、脂肪醇和脂肪酸乙酯的工程菌株；更重要的是，通過向E. coli中導入來源于糞堆梭菌Clostridium stercorarium的木聚糖內切酶基因和來源于卵形擬桿菌Bacteroides ovatus的木聚糖酶基因，工程菌株可以直接利用木聚糖為碳源產生脂肪酸乙酯[51]。日本Kamisaka等敲除了S. cerevisiae的轉錄因子SNF2，進一步過表達甘油二酯?；D移酶，突變株油脂含量提高到30%[52]。值得注意的是，雖然E. coli、S. cerevisiae等模式材料易于進行遺傳操作，但它們產生脂肪酸代謝衍生物，尤其是油脂，的能力還遠低于已知的產油微生物菌株。模式材料衍生的工程菌株可能存在如產物耐受性低、原料適應范圍窄、抗逆性弱等性狀缺陷。因此，選擇合適的宿主進行改造，已逐步受到重視和認可，并將成為今后研究的熱點[53]。針對產油能力突出的R. toruloides，本實驗室已著手開展其營養(yǎng)缺陷型菌株和遺傳操作方法研究[42,54]。開展產油微生物基因工程和靶向性菌株改造研究，將是未來重要的研究方向之一。

總之，將生物質資源轉化為包括油脂在內的脂肪酸代謝衍生物，已經成為當前生物能源研究的重要方向，日益受到重視[55]。能源微生物油脂技術可為生物柴油產業(yè)提供原料，已經取得很大進展。但是，規(guī)?；a微生物油脂，正如規(guī)?；a其他生物燃料產品一樣，仍然面臨著困難[56]。隨著現代生物技術和合成生物學不斷發(fā)展，能源微生物油脂研究在生物煉制和綠色化學理念指導下，將持續(xù)改善過程的綜合技術經濟性，最終為生物燃料生產提供可靠技術。

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Progress in bioenergy-oriented microbial lipid technology

Zongbao K. Zhao1,2, and Cuimin Hu1,3
1 Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China
2 Dalian National Laboratory for Clean Energy, Dalian 116023, China
3 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Received: November 11, 2010; Accepted: December 23, 2010

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB707405).Corresponding author: Zongbao K. Zhao. Tel: +86-411-84379211; E-mail: zhaozb@dicp.ac.cn

國家重點基礎研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2011CB707405) 資助。