王卓，趙雄，呂茂民，章金剛

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所，北京 100850

血液制品 (Blood products) 是由健康人血漿或經(jīng)特異免疫的人血漿，經(jīng)分離、提純或由重組DNA技術(shù)制備的血漿蛋白組分，以及血液細胞有形成分的統(tǒng)稱[1]。不同國家和學(xué)者對血液制品的理解稍有偏差，一般分為“廣義”和“狹義”兩類。廣義的血液制品是指經(jīng)過物理、化學(xué)、生化、生物等技術(shù)制備的血液與血液相關(guān)的制品，包括全血與成分血制品、血漿蛋白制品等；狹義的血液制品則為經(jīng)過生化提取、基因重組、轉(zhuǎn)基因動植物等技術(shù)制備的血漿蛋白與重組血漿蛋白制品。其中，血漿蛋白制品在國際上通常稱為血漿衍生制品。

本文在簡要歸納血漿蛋白特性與分類的基礎(chǔ)上，結(jié)合重組血漿蛋白制品的應(yīng)用與研發(fā)，分別重點介紹了白蛋白、免疫球蛋白、多種凝血因子以及其他血漿蛋白制品的現(xiàn)狀，并對其未來趨勢進行了展望。

1 血漿蛋白的特性與制品分類

血漿是去除了紅細胞、白細胞、血小板等有形成分后的血液無形成分，為淡黃色的清亮液體，約占全血體積的55%。在血漿成分中，水占90%，蛋白質(zhì)占 7%，糖、脂、氨基酸、電解質(zhì)、核苷類和其他代謝產(chǎn)物占3%。

1.1 血漿蛋白的特性

與體內(nèi)其他蛋白相比，血漿蛋白具有其特殊性，執(zhí)行著機體的多種生理/病理學(xué)效應(yīng)[2]。不同血漿蛋白的含量與特性，對血漿蛋白制品研發(fā)中的技術(shù)選擇和成藥性具有極其重要的意義。

1.1.1 種類繁多

常規(guī)技術(shù)可以鑒定的、具有特定生理功能的血漿蛋白成分達 200余種，已經(jīng)分離純化的已有數(shù)十種，研究較多的有近百種。近年來隨著蛋白質(zhì)組技術(shù)的發(fā)展，血漿蛋白的數(shù)量成指數(shù)增長，可以證實的不同蛋白點達10 000以上。人們根據(jù)血漿蛋白的不同含量，將其分為大量蛋白、中量蛋白、小量蛋白、微量蛋白和痕量蛋白?？梢哉J為，血漿蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)的熱點之一，并將對血漿蛋白的認識產(chǎn)生積極的影響。

1.1.2 功能多樣

由于血漿蛋白的種類繁多，其生理功能多種多樣，對機體的有序運行起著極為重要的作用。機體的免疫、凝血和抗凝血以及激素、藥物、營養(yǎng)物質(zhì)傳遞等均與血漿蛋白有關(guān)。血漿蛋白質(zhì)組技術(shù)的研究成果，將會發(fā)現(xiàn)許多新的血漿蛋白，賦予血漿蛋白更多的功能，進而推動重組技術(shù)的應(yīng)用和重組產(chǎn)品的問世。

1.1.3 性質(zhì)特殊

血漿蛋白因其種類和功能不同，而表現(xiàn)出不同的性質(zhì)，使得血漿蛋白的重組表達與純化技術(shù)具有很大的特殊性。白蛋白雖然結(jié)構(gòu)相對比較簡單，但其含量高，靜脈輸注量大，重組產(chǎn)品的雜蛋白總量很難達到安全性要求；免疫球蛋白、各種凝血因子往往存在復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和化學(xué)修飾，原核細胞表達難以獲得與天然產(chǎn)物相近或相同的產(chǎn)品。盡管哺乳細胞表達可以獲得與天然產(chǎn)物相近或相同的產(chǎn)品，但是其表達量很低，純化也比較困難，難以達到產(chǎn)業(yè)化的目的。

1.2 血漿蛋白制品的原料來源與技術(shù)途徑

一般來講，血漿蛋白制品的來源是健康人的血漿。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，制備血漿蛋白的原料顯然不僅限于人體來源，工程細胞株和轉(zhuǎn)基因動物已經(jīng)有多種產(chǎn)品上市，轉(zhuǎn)基因植物的研究也呈現(xiàn)了良好的發(fā)展前景。

1.2.1 原料血漿

原料血漿是指以單采血漿術(shù)采集的供生產(chǎn)血漿蛋白制品用的健康人血漿。原料血漿是血漿蛋白工業(yè)的源頭，保證充足而高品質(zhì)的原料血漿供應(yīng)是血漿蛋白工業(yè)發(fā)展的先決條件[3]。

為確保原料血漿的質(zhì)量，各國監(jiān)管部門均有嚴格的標準。在對采集的血漿進行蛋白含量、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT)、HBsAg、梅毒、HIV-1抗體、HIV-2抗體和HCV抗體檢測的同時，還要求有3個月的檢疫期。

原料血漿采集后一般在?20 ℃或?20 ℃以下保存。用于分離人凝血因子Ⅷ的血漿保存期不應(yīng)超過1年；用于特異性免疫球蛋白制備的血漿，單人份血漿及混合血漿的抗體效價應(yīng)分別制定明確的合格標準；用于分類其他血漿蛋白制品的血漿保存期不應(yīng)超過3年。

1.2.2 基因工程細胞

基因重組的宿主系統(tǒng)一般分為大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等。鑒于多數(shù)血漿蛋白制品存在復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和化學(xué)修飾，大腸桿菌系統(tǒng)難以滿足要求。常用的工程細胞株通常有酵母和哺乳動物細胞，如用畢赤酵母表達白蛋白，中國倉鼠卵巢細胞 (CHO) 表達重組人凝血因子Ⅷ和Ⅸ，HEK293細胞表達重組人蛋白C等。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因動物

轉(zhuǎn)基因動物的一個重要應(yīng)用就是生物制藥，其中乳腺是外源基因在轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)最理想的表達場所[4]。

目前，已經(jīng)有轉(zhuǎn)基因小鼠、兔、綿羊、山羊、豬、牛、雞和魚等多種轉(zhuǎn)基因動物問世。多種蛋白已經(jīng)實現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因動物的乳腺表達，如抗凝血酶和α1-抗胰蛋白酶等，其中轉(zhuǎn)基因奶山羊的抗凝血酶已經(jīng)在美國批準上市。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植物

轉(zhuǎn)基因植物作為藥用蛋白表達系統(tǒng)，可以克服原核表達系統(tǒng)如細菌難以完成的外源蛋白修飾和正確折疊的缺陷，在規(guī)?；a(chǎn)、安全性和生產(chǎn)成本方面比傳統(tǒng)的細菌、動物細胞和轉(zhuǎn)基因動物系統(tǒng)均具有較大優(yōu)勢[5-6]。目前，已經(jīng)有 35科 120多種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功，如水稻、小麥、玉米等等。

轉(zhuǎn)基因植物可以用于疫苗、藥用蛋白以及抗體的生產(chǎn)，如乙型肝炎表面抗原、大腸桿菌不穩(wěn)定腸毒素 (LT2B) 抗原、諾沃克病毒衣殼蛋白、口蹄疫病毒VP1 抗原、霍亂抗原、狂犬病毒糖蛋白等。血漿蛋白，如人凝血因子Ⅸ也處于研究之中。

1.3 血漿蛋白制品的分類

血漿中現(xiàn)已明確分子結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)有 100多種，而已經(jīng)分離出來用于臨床的產(chǎn)品僅20余種。

在這20余種血漿蛋白制品，具有不同的分類方法。按照生理功能，可以分為轉(zhuǎn)輸?shù)鞍最悺⒚庖咔虻鞍最?、凝血系統(tǒng)蛋白類和蛋白酶抑制物。按照原料來源與技術(shù)途徑，可以分為血漿蛋白制品和重組血漿蛋白制品。按照應(yīng)用于臨床的種類，可以分為白蛋白類、免疫球蛋白類、凝血因子類和微量蛋白。本文即按最后一種分類方法進行介紹。

2 白蛋白與重組白蛋白制品

2.1 白蛋白的特性與生理功能

白蛋白 (又稱清蛋白，albumin，Alb) 是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)。人血清白蛋白 (Human serum albumin，HSA) 約占血漿蛋白質(zhì)的 50%~60% (35~55 g/L)，半衰期為13.5 d。HSA是由肝臟合成的單鏈、非糖基化蛋白質(zhì)，占肝臟合成蛋白總量的25%和分泌蛋白總量的50%。

成熟的HSA共有585個氨基酸殘基，肽鏈緊密折疊成13 nm×13 nm的球形蛋白，含有17對鏈內(nèi)二硫鍵。HSA的結(jié)構(gòu)特點賦予了白蛋白分子的熱穩(wěn)定性和強可溶性，進而在體內(nèi)起著維持血漿膠體滲透壓、營養(yǎng)運輸、抗凝血、清除自由基和保護其他重要生物物質(zhì)的作用[7]。

白蛋白所產(chǎn)生的膠體滲透壓約占血漿膠體總滲透壓 (25~33 mmHg) 的75%~80%，1 g白蛋白產(chǎn)生的滲透壓相當于20 mL液體血漿或40 mL全血。白蛋白的分子結(jié)構(gòu)使其能與游離脂肪酸、膽紅素、某些類固醇激素、某些金屬陽離子、酶和藥物等多種物質(zhì)結(jié)合，并且還能結(jié)合有毒物質(zhì)，將其運送至解毒器官，排出體外。組織蛋白和血漿蛋白可互相轉(zhuǎn)化，為組織提供營養(yǎng)，促進肝細胞的修復(fù)和再生。白蛋白鹽與白蛋白形成緩沖對，參與維持血漿正常的pH。

除了用于治療燒傷、失血引起的休克，防治低蛋白血癥及肝硬化或腎病引起的水腫或腹水，HSA還能作為許多宿主細胞和工程細胞株的培養(yǎng)基成分以及生物制品的穩(wěn)定劑。

2.2 血漿來源的白蛋白制品

血漿白蛋白制品的研發(fā)動力來自于戰(zhàn)爭需求。第二次世界大戰(zhàn)期間，前線急需的大量全血或血漿無法解決，美國軍方委托哈佛醫(yī)學(xué)院的Cohn教授制備相應(yīng)的替代品。最初的產(chǎn)品是采用動物血漿和動物血清白蛋白用于人體，并且建立了一整套分離牛血漿中白蛋白的分離技術(shù) (Cohn氏法)。但是，在搶救了許多傷病員的同時，嚴重的后發(fā)不良反應(yīng)陸續(xù)出現(xiàn)，因此，Cohn在與美國紅十字會合作時，用上述低溫乙醇沉淀法從人血漿中分離純化出高純度人血清白蛋白并進行了大量臨床應(yīng)用，取得了良好的救治效果?，F(xiàn)代血漿蛋白制備工藝和產(chǎn)業(yè)雛形也因Cohn氏法的推廣得到了發(fā)展。

雖然 Cohn氏法組分Ⅴ制備的人血清白蛋白在體內(nèi)具有很好的耐受性，但其中仍含有能夠引起不良反應(yīng)的蛋白成分，包括結(jié)合珠蛋白、血凝素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂蛋白、變性白蛋白/聚合體、GC-球蛋白、內(nèi)毒素、鋁離子等。隨后，不同廠家和學(xué)者均致力于工藝改進和產(chǎn)品質(zhì)量的提高，加之巴氏滅活病毒工藝的引入，人血白蛋白制品已經(jīng)成為最為安全的生物制品之一。

近年來，高純度白蛋白成為一個發(fā)展方向。Kister-Nitschmann方法分離組分Ⅴ，再經(jīng)離子交換層析純化的白蛋白，超過了歐洲藥典的相關(guān)要求，具有更高的純度，更高白蛋白單體含量，其白蛋白純度＞98%，單體含量＞95%，鋁含量＜25 μg/L，降低了內(nèi)毒素含量 (無不合格批次)，改進了穩(wěn)定性，白蛋白顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色[8]。一體化制造過程的引進和層析條件的優(yōu)化，使利用組分Ⅴ生產(chǎn)高純度血清白蛋白的方法能夠運用到大規(guī)模的生產(chǎn)中，提高了血清白蛋白臨床使用的安全性。

2.3 重組白蛋白制品

鑒于血漿來源白蛋白的某些局限性，應(yīng)用基因工程技術(shù)表達重組人血清白蛋白 (rHSA) 一直是產(chǎn)業(yè)界關(guān)注的熱點之一。從適應(yīng)癥來看，重組白蛋白可以分為兩大類，即輸注用重組白蛋白和培養(yǎng)基/輔料用重組白蛋白，并且均已有相應(yīng)的產(chǎn)品上市。

白蛋白已在多種系統(tǒng)中獲得表達，但是其臨床用量決定了研發(fā)難度。rHSA最初在大腸桿菌中表達成功，表達量為細胞總蛋白的7%，但因為HSA含有大量的二硫鍵，使大腸桿菌表達的蛋白難以正確折疊，未能得到有生物功能的重組蛋白；同時細菌細胞壁脂多糖造成熱反應(yīng)也帶來很多麻煩[9]。

酵母作為真核生物具有對所表達的蛋白翻譯后修飾等功能，適用于重組白蛋白的制備。目前，rHSA主要在畢赤酵母中表達[10]。在畢赤酵母表達系統(tǒng)中，重組白蛋白的分泌量高 (可達到10~20 g/L)，表達穩(wěn)定，可形成正確的折疊，以成熟的蛋白分泌到培養(yǎng)基中。Ohnishi等[11]分析比較了畢赤酵母生產(chǎn)的rHSA和血漿純化白蛋白的理化性質(zhì)和免疫化學(xué)特性，結(jié)果顯示二者在分子組成、結(jié)構(gòu)及生理功能上基本一致；Bosse等[12]還進行了rHSA在人體內(nèi)的耐受性、安全性、及藥物代謝動力學(xué)等研究，rHSA與天然HSA表現(xiàn)出相同的性質(zhì)。由此可見，rHSA可作為天然HSA的替代品用于臨床。

雖然世界上許多實驗室及公司都在進行 rHSA的研發(fā)，但實現(xiàn)藥物級 rHSA的大規(guī)模生產(chǎn)仍是個極具挑戰(zhàn)性的課題。目前，在該領(lǐng)域領(lǐng)先的主要有日本的Green Cross公司，美國的Genetech公司和英國的Delta公司。前者生產(chǎn)的rHSA已通過Ⅲ期臨床試驗，2008年日本Mitsubishi公司 (前Green Cross公司) 推出純度為99.999 999%的rHSA (Medway)，是目前國際市場上純度最高、生產(chǎn)規(guī)模最大且成本最低的重組白蛋白。英國的Delta公司已經(jīng)完成Ⅰ期臨床試驗，美國Genetech公司處于臨床前的中試研究階段。近幾年來，我國多家單位已經(jīng)開展基因重組白蛋白的研究并取得了一定的進展。

除注射用rHSA以外，英國Novozymes 公司和我國華北制藥已獲得輔料級rHSA生產(chǎn)的批文。2010年3月，Novozymes公布的最新數(shù)據(jù)顯示，作為藥物保護劑的上市重組白蛋白產(chǎn)品 Recombumin能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)藥品組分并防止其降解，從而有效延長藥品貨架壽命、加強藥品效能。

由于靜脈輸注的白蛋白用量大，rHSA這一用途很難獲得藥品管理當局的批準。但是，疫苗生產(chǎn)用的培養(yǎng)基添加物和保護劑等對rHSA的需求量很大，使得重組白蛋白的市場前景看好。

2.4 重組白蛋白融合藥物

利用白蛋白作為融合蛋白制備的長效藥物也已成為近年來研究和開發(fā)的重點，并有部分產(chǎn)品正在進行臨床試驗。

美國Human Genome Science公司已經(jīng)進行了一系列與 HSA融合蛋白延長蛋白質(zhì)藥物半衰期的研究，其蛋白質(zhì)藥物HSA/IFN-α已經(jīng)完成了Ⅱ期臨床試驗；處于臨床早期研發(fā)階段的融合蛋白藥物如HSA/IFN-β (Albuferon-β)、HSA/rIL-2 (Albuleukin)、HSA/rG-GSF (Albugranin) 和HSA/rHGH (Albutropin)等，都顯示出了很好的安全性、耐受性以及較理想的半衰期；我們將人內(nèi)皮抑素與白蛋白通過柔性肽相連，在畢赤酵母中所表達的重組融合蛋白可以有效抑制ECV-304細胞的增殖，表現(xiàn)出較高的生物學(xué)活性[13]。

另外，Wang等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，白蛋白DNA與四苯基卟啉結(jié)合形成融合蛋白rHSA-FePⅡ，在生理條件下能夠可逆地結(jié)合或釋放氧，與血紅蛋白的生理功能很相似，并且其呈現(xiàn)出較好的人全血兼容性，可在體內(nèi)大量地運輸氧氣，被認為是合成人紅細胞代用品的理想材料。

由此可知，白蛋白融合蛋白除具有該活性蛋白的生物學(xué)作用外，還能提高蛋白在體內(nèi)的穩(wěn)定性和生物學(xué)活性，為白蛋白的研究和開發(fā)提供了更廣闊的市場前景。

3 免疫球蛋白與特異性免疫球蛋白制品

免疫球蛋白 (Immunogloblin，Ig) 是指具有抗體活性或分子結(jié)構(gòu)上與抗體相似的一類球蛋白，其主要作用是通過特異性結(jié)合相應(yīng)抗原、活化補體以及結(jié)合 Fc受體產(chǎn)生抗體依賴的細胞介導(dǎo)細胞毒作用和調(diào)理吞噬作用，阻斷或消除各種病原體對人體的致病作用。

3.1 免疫球蛋白的特性與制品分類

免疫球蛋白是血漿中除白蛋白外含量最豐富的血漿蛋白質(zhì)，約占血漿蛋白總量的 12%~15%。其中，免疫球蛋白 G (IgG) 約占免疫球蛋白總量的70%~80%，是最重要的一類免疫球蛋白，臨床使用的免疫球蛋白制品中主要是IgG。

免疫球蛋白分子的基本單位都是由 4條肽鏈構(gòu)成的對稱結(jié)構(gòu)，包括2條相同的重鏈和2條相同的輕鏈，其中，輕鏈又分為κ和λ 2種結(jié)構(gòu)類型。在人體內(nèi)，血漿免疫球蛋白可分為5種類型，每種都有特殊的結(jié)構(gòu)和功能，分別命名為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。其中，IgG又包括4個亞型，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，IgA和IgD也分別由2個亞型，這些差異是由Ig分子上氨基酸序列的不同所致，很多情況是由Ig微小的抗原差異性造成的。

免疫球蛋白的應(yīng)用可以追溯到1891年，Behring等應(yīng)用能中和白喉毒素抗體的羊血清治愈白喉患兒，開創(chuàng)了免疫球蛋白治療新時代。由于當時科學(xué)技術(shù)的限制，Behring等的異源免疫球蛋白具有較大的副作用，而且難以規(guī)?；苽洹?/p>

直到上世紀中期，Cohn-Oncley法[15]和 Kistler-Nitchmamn法[16]的建立使得規(guī)?；a(chǎn)免疫球蛋白成為可能。上述兩種方法，已經(jīng)成為當前制備免疫球蛋白的兩種核心技術(shù)，發(fā)展出了多種應(yīng)用于臨床的免疫球蛋白制品，并且不斷推出新的適應(yīng)癥。

目前，已經(jīng)上市的免疫球蛋白制品已有近 20種。根據(jù)原料血漿的特性和制品的功能效應(yīng)，可以分為正常人免疫球蛋白和針對不同病原/抗原的各種特異性免疫球蛋白；根據(jù)注射途徑，可以分為肌肉注射用免疫球蛋白、靜脈注射用免疫球蛋白和皮下注射用免疫球蛋白3大類。

免疫球蛋白作為傳統(tǒng)的抗體治療制劑已經(jīng)有了百年的歷史，歷經(jīng)了從動物源免疫球蛋白到人源免疫球蛋白，從肌肉注射免疫球蛋白到靜脈注射免疫球蛋白，從正常免疫球蛋白到特異性免疫球蛋白的發(fā)展歷程。免疫球蛋白的使用范圍和適應(yīng)癥不斷擴大，在疾病的預(yù)防和治療領(lǐng)域的作用也日益增強。

3.2 肌肉注射用免疫球蛋白

傳統(tǒng)免疫球蛋白制品，特別是特異性免疫球蛋白制品的輸注途徑是肌肉注射。與異源抗血清相比，可以避免相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生。其主要適應(yīng)癥為免疫低下癥、替代治療、預(yù)防某些病毒和細菌感染等。

最初制備的免疫球蛋白曾嘗試用于靜脈注射，但是靜脈注射后會產(chǎn)生比較嚴重的副作用，所以當時的免疫球蛋白主要用于肌肉注射。由于肌肉注射的劑量受限，大部分的免疫球蛋白在進入血液循環(huán)前被酶解，使得其利用率較低。

盡管如此，肌肉注射免疫球蛋白由于其制備工藝相對簡單，并且具有使用方便、價格低廉、不良反應(yīng)可以接受等特點一直在臨床實踐中使用。

3.3 靜脈注射用免疫球蛋白

上世紀60年代起，免疫球蛋白靜脈輸注所產(chǎn)生的嚴重副反應(yīng)原因被逐步揭示，主要原因是制劑中存在著與IgG聚合體相關(guān)的抗補體活性 (ACA)。于是，靜注免疫球蛋白 (Intravenous immunoglobulin，IVIG) 研制的工作主要集中在防止 IgG聚合體的出現(xiàn)，從而減少ACA的研究上。

IVIG的制備技術(shù)主要經(jīng)歷了3次變革和發(fā)展[17]，即第1代的酶解法制備產(chǎn)品、第2代的化學(xué)修飾法制備產(chǎn)品和第 3代的天然結(jié)構(gòu)免疫球蛋白產(chǎn)品，至今已形成了比較完善的制備工藝，其中第 3代產(chǎn)品既去除了抗補體活性，又能夠保持IgG的完整生物學(xué)功能。

目前上市的IVIG制品均為第3代制品，同時又引入了兩步病毒滅活工藝，使得制品在輸注安全和病毒安全等方面有了很大的提高。

IVIG主要通過抗體補充和免疫調(diào)節(jié)作用對多種疾病起到治療作用，其應(yīng)用范圍和適應(yīng)癥有原發(fā)性及繼發(fā)性免疫缺陷癥、各種自身免疫性疾病、細菌性和病毒性感染等[18-21]。新近的適應(yīng)癥還有周期性自發(fā)性流產(chǎn)、癌癥以及預(yù)防過多膠原積聚[22]。隨著臨床應(yīng)用范圍的不斷擴大，許多新的適應(yīng)癥也在不斷被發(fā)現(xiàn)[23]。

3.4 皮下注射用人免疫球蛋白

皮下注射用人免疫球蛋白 (Subcutaneous injection immunoglobulin，SCIG)，是一種新的輸注方式的免疫球蛋白。美國FDA分別于2006年和2010年批準了ZLB Bering公司的皮下注射用人免疫球蛋白Vivaglobin和CSL公司的皮下注射用人免疫球蛋白Hizentra上市。

該制品的優(yōu)點是能夠在室溫 (不超過25 ℃) 下保存，隨時可用，易于攜帶，病人可在家自行接受治療，也適于靜脈通路差或?qū)VIG有反應(yīng)的病人。目前批準的適應(yīng)癥為治療原發(fā)性免疫缺陷病(PIDD)，其治療效果與常規(guī)靜脈注射效果相似，是靜脈注射用免疫球蛋白的安全和有效的替代品。

SCIG含有純度為98%的IgG，是濃度為20%的液體制劑。采用低溫乙醇分離，結(jié)合辛酸-陰離子交換層析制備工藝[24]，通過S/D和納米膜過濾兩步病毒去除工藝確保制品的病毒安全性，另外，辛酸鹽的使用也有助于病毒的去除[25]。該制備工藝中IgG不會受到化學(xué)或酶的修飾，保留了完整 IgG分子的Fc和Fab功能。

SCIG在皮下注射時需要專用輸液泵進行輸注，輸注時采用多部位輸注，每個部位最大輸注量不超過25 mL，每個部位輸注速率控制在15~20 mL/h。多部位同時輸注時，最大輸注速率不要超過所有合并輸注部位總共50 mL/h。

3.5 特異性免疫球蛋白

近一個世紀以來，特異性免疫球蛋白 (Specific immunoglobulin) 一直用于預(yù)防和治療一些發(fā)病率高、感染后果嚴重、無特效治療方法的病原體感染，在臨床上具有非常重要和不可替代的作用。

特異性免疫球蛋白是指針對某一特定病原體的免疫球蛋白，是用特定疫苗或抗原免疫獻漿員，或篩選自然感染者而獲得。采用血漿蛋白分離和純化技術(shù)可將原料血漿中的特異性免疫球蛋白 (IgG)制備成相應(yīng)的制品。與正常免疫球蛋白不同，特異性免疫球蛋白是一種有高度特異性、高比活性、高效價抗體的被動免疫制劑。

特異性免疫球蛋白的制備技術(shù)與工藝基本與肌肉注射免疫球蛋白或靜脈注射免疫球蛋白的制備工藝相同，其關(guān)鍵點和難點主要取決于能夠獲得高滴度特異性抗體的原料血漿和建立快速、準確的血漿特異性抗體效價篩查方法。由于原料血漿的特異性抗體滴度高低取決于單份血漿的檢測，在規(guī)?；a(chǎn)的情況下，所涉及的單份血漿檢測量非常大，因此要求篩查所采用的檢測技術(shù)操作簡單、快速而且準確；選擇適合的抗體檢測方法并對方法學(xué) (包括重復(fù)性和準確性) 進行充分的驗證，是保證檢測結(jié)果準確可靠和原料血漿質(zhì)量的關(guān)鍵。

目前，以人血漿為原料制造的特異免疫球蛋白制品已經(jīng)有十余種，按其針對的抗原可以分為以下4類：抗病毒類特異性免疫球蛋白，包括巨細胞病毒 (CMV) 免疫球蛋白、呼吸道合胞病毒 (RSV)免疫球蛋白、水痘-帶狀皰疹病毒 (VZV) 免疫球蛋白、痘苗特異性免球蛋白、風疹免疫球蛋白、麻疹免疫球蛋白、甲肝免疫球蛋白、乙型肝炎免疫球蛋白、狂犬病免疫球蛋白等；抗細菌類的特異性免疫球蛋白，包括布氏菌特異性免疫球蛋白、炭疽桿菌免疫球蛋白等；抗毒素類的特異性免疫球蛋白，如破傷風免疫球蛋白等；此外還有抗Rh (D) 免疫球蛋白等。

4 凝血因子類制品

凝血因子類制品種類繁多，主要用于相應(yīng)的先天性遺傳性缺陷患者。現(xiàn)代的凝血因子制劑制備主要是基于低溫乙醇法和其他新方法、新技術(shù)的結(jié)合，即離子交換層析、親和層析以及超濾法等，并且采用了有效的病毒滅活/清除方法。上述方法制備的凝血因子制劑具有較高的純度和活性，而且使用安全，發(fā)生HIV、HBV或HCV感染的可能性已經(jīng)極小[26]。

國內(nèi)外已上市的凝血因子類制品，按照來源可以分為血漿來源和重組來源兩大類。血漿來源的凝血因子類制品包括纖維蛋白原、凝血酶、因子Ⅶ、因子Ⅷ、von Willebrand因子制劑、因子Ⅸ、凝血酶原復(fù)合物、因子Ⅺ和因子ⅩⅢ。重組來源凝血因子類制品包括凝血酶、因子Ⅶ、因子Ⅷ、因子Ⅸ。

4.1 纖維蛋白原

纖維蛋白原 (Fibrinogen，F(xiàn)g) 即凝血因子Ⅰ，是凝血過程中一連串凝血因子相繼激活的最終底物。Fg由兩個相同的亞單位組成，每個亞單位有3條不同的多肽鏈，分別為α鏈、β鏈和γ鏈。凝血的第 3階段，在凝血酶的作用下，先由 α鏈脫去A肽，繼而 β鏈脫去 B肽，纖維蛋白原被水解成纖維蛋白。纖維蛋白分子相互聚合，在FⅩⅢ的作用下，交聯(lián)成穩(wěn)定的不可逆的多聚體，進而發(fā)生凝血/止血效應(yīng)。

早在20世紀40年代，采用Cohn低溫乙醇法分離出來的Fg制品就已應(yīng)用于臨床；但當時Fg制品的生產(chǎn)工藝中尚不含對制品的病毒滅活處理，這導(dǎo)致患者在輸注后引起病毒性肝炎的危險性很大，美國FDA于1978年7月禁止其使用。Fg制品病毒滅活方法的研究取得成功，使該制品又重新開始生產(chǎn)[27]。

目前，F(xiàn)g制品有2類，即注射用Fg制品和外用 Fg制品。前者主要為凍干人 Fg，適應(yīng)證主要有先天性無或低纖維蛋白血癥、繼發(fā)性纖維蛋白原缺乏、彌漫性血管內(nèi)凝血 (DIC) 及原發(fā)性纖維蛋白溶解癥等；后者是纖維蛋白膠 (Fibrin sealant)，其在外科止血方面發(fā)揮著極其重要的作用[28-29]，對組織粘合、促進縫合創(chuàng)口愈合及封閉內(nèi)空腔也有一定的作用[30]。

在注射用Fg制品方面，2009年，美國FDA重新批準了CSL公司的靜脈輸注人Fg 制品RiaSTAP上市，用于先天性無/低纖維蛋白原血癥引起的急性出血。國內(nèi)曾啟動靜脈注射用Fg的再注冊機制，目前已有多家廠商的產(chǎn)品上市或正在注冊中。

在外用纖維蛋白制品方面，F(xiàn)DA先后批準上市了Baxter公司的纖維蛋白膠TISSEEL，Omrix公司的纖維蛋白膠EVICEL，Baxter公司生產(chǎn)的纖維蛋白膠 ARTISS，Nycomb公司生產(chǎn)的纖維蛋白止血貼TachoSil。

在國內(nèi)，SFDA先后批準了華蘭生物、上海萊士等公司生產(chǎn)的人纖維蛋白膠上市，尚未有纖維蛋白止血貼上市。我們開展了纖維蛋白止血貼的研制，取得了可喜的進展[31-32]，準備進一步開展臨床試驗。

4.2 凝血酶

凝血酶 (Thrombin) 是由 308個氨基酸組成的蛋白水解酶，相對分子質(zhì)量約為36 000，由A鏈和B鏈組成。凝血酶A鏈的功能尚不十分清楚，可能對凝血酶的整體結(jié)構(gòu)與功能起穩(wěn)定作用[33]；B鏈是其活性中性所在部位，通過對多種凝血因子的蛋白水解作用而參與凝血過程。

作為局部止血藥，2003年中國SFDA批準上海萊士血液制品有限公司的外用凍干人凝血酶上市，輔助用于處理腹部切開創(chuàng)面的滲血。在 2005年批準華蘭生物工程股份有限公司的外用凍干人凝血酶上市。

2007年，美國FDA批準了Omrix公司生產(chǎn)的凝血酶，商品名為 Evithrom，用于處理毛細血管和小靜脈的滲血。

2008年，美國FDA批準ZymoGenetics公司的重組凝血酶外用制劑 (Recothrom) 上市用于局部止血。該產(chǎn)品是首個和迄今唯一獲準上市的用于局部止血的重組無血漿藥品。Recothrom采用經(jīng)過基因修飾過的CHO細胞為表達細胞株，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與功能與人凝血酶相類似[34]。基于一項411例病人參加的Ⅲ期臨床關(guān)鍵試驗，該產(chǎn)品被證實與牛凝血酶有同等的功效和相似的副作用譜，卻顯著減少抗體產(chǎn)生幾率[35-36]。

4.3 因子Ⅶ

凝血因子Ⅶ (FⅦ) 是一種維生素K依賴性血漿糖蛋白，由肝臟實質(zhì)細胞分泌，在血漿中以酶原形式存在?；罨?FⅦ以單一多肽鏈形式存在，經(jīng)活化轉(zhuǎn)變成活性 FⅦ (FⅦa) 后，其促凝活性明顯增加，與組織因子 (tissue factor，TF) 結(jié)合形成復(fù)合體TF/FⅦa激活下游凝血因子。另外，F(xiàn)Ⅶa能夠活化FⅨ進而參與內(nèi)源性凝血。

Broze等[37]以新鮮冰凍血漿為原料，經(jīng)過硫酸鋇吸附和硫酸銨分離以及三步層析，F(xiàn)Ⅶ被濃縮105倍，活力回收率達到 30%。Tomokiyo等[38]以冷沉淀為原料，應(yīng)用陰離子交換和免疫親和層析獲得FⅦ，然后分別采用納米過濾和Ca2+孵育激活FⅦ，從而建立大規(guī)模制備FⅦa的方法。

鑒于血漿FⅦ的來源有限，重組FⅦ成為研發(fā)的重點之一。Novo Nordisk公司為靜脈注射rhFⅦa先后在歐洲、美國和我國注冊，用于先天性 FⅦ缺乏或凝血因子產(chǎn)生抑制物的獲得性血友病病人出血發(fā)作和預(yù)防手術(shù)出血。

國內(nèi)對rhFⅦa進行了一系列的研究，但相關(guān)報道不多。我們先后在不同哺乳動物細胞中實現(xiàn)了rhFⅦa的表達，并建立了相應(yīng)的純化方法[39-42]。

臨床試驗表明，rhFⅦa具有良好的安全性和有效性，為血友病人的治療展示了樂觀的前景[43-44]。隨著rhFⅦa臨床應(yīng)用范圍的不斷擴大，許多新的適應(yīng)癥也在不斷被發(fā)現(xiàn)[40]。

4.4 因子Ⅷ

凝血因子Ⅷ (FⅧ)，又稱為抗血友病因子，在內(nèi)源性凝血體系中具有十分重要的作用，是激活凝血因子Ⅸ的輔助因子。FⅧ由血管內(nèi)皮細胞分泌入血，是來自肝外的唯一凝血因子，由高分子量部分 (ⅧR：Ag) 和小分子量部分 (Ⅷ：C) 兩種成分組成。

已有多種方法用于從冷沉淀中提取因子Ⅷ濃制劑，如低溫乙醇沉淀、聚乙二醇沉淀、甘氨酸萃取法、氫氧化鋁純化法、離子交換層析和親和層析等。1996年FDA首次批準Baxter公司血漿來源的人抗血友病因子Hemofil M。2000年批準ZLB公司的巴氏消毒，單克隆抗體純化的血漿來源的人抗血友病因子Monoclate-P。2002?2003年，SFDA先后批準上海萊士、華蘭生物等公司生產(chǎn)的凍干人凝血因子Ⅷ。

基因重組因子Ⅷ (rFⅧ) 是第 1個上市的重組凝血因子制品。1992年FDA 批準了Baxter公司的第1代rhFⅧ產(chǎn)品Recombinate，該產(chǎn)品是用經(jīng)遺傳工程化CHO細胞株合成的糖蛋白。1993年FDA批準了Bayer公司利用經(jīng)人因子Ⅷ轉(zhuǎn)染的BHK細胞生產(chǎn)的Kogenate FS。1999年和2000年歐洲和美國分別批準Genetics Institute的缺失B-結(jié)構(gòu)區(qū)rhFⅧ產(chǎn)品ReFacto。2003年FDA批準了Baxter公司的第2代無血漿白蛋白rhFⅧ制品Avate。2007年，SFDA批準了首個國內(nèi)上市的rFⅧ拜科奇。

長達20年的臨床應(yīng)用表明，rFⅧ與天然FⅧ具有相似的生化、免疫及藥理學(xué)特性，能有效糾正血友病患者的出血傾向，具有良好的治療效果[45]。由于rFⅧ具有較為明確的臨床療效指標，普遍認為它是一個具有良好應(yīng)用前景和巨大經(jīng)濟效益的基因工程藥物。目前，加拿大與愛爾蘭幾乎所有血友病患者、美國 70%以上重癥血友病患者使用 rhFⅧ進行治療。

4.5 von Willebrand因子復(fù)合物

von Willebrand因子復(fù)合物作為凝血因子Ⅷ的載體蛋白，用于血管性假性血友病 (vWD) 等的治療。vWD是由于血漿中vWF的質(zhì)和量的缺陷而引起的出血傾向為主的疾病，一般采用新鮮冰凍血漿、冷沉淀和von Willebrand因子復(fù)合物進行治療。

1978年，Grifols公司的von Willebrand因子復(fù)合物 Alphanate上市。1991年法國里爾輸血中心通過氫氧化鋁吸附和 3次層析，研制出一種高純 von Willebrand因子復(fù)合物。2000年 CSL公司的 von Willebrand因子復(fù)合物Humate-P上市。

4.6 因子Ⅸ

因子Ⅸ (FⅨ) 為一種維生素 K依賴性血漿蛋白，在肝臟中合成并經(jīng)過了糖基化修飾分泌至血液，正常人血漿含量為 50~70 mg/L。FⅨ在凝血級聯(lián)反應(yīng)中不僅是必須的蛋白因子，而且當 FⅨ與調(diào)控蛋白 FⅧ形成復(fù)合物后，使反應(yīng)速度成千倍增加，致使凝血過程僅在幾分鐘內(nèi)即可完成。當人體內(nèi)缺乏FⅨ時，會導(dǎo)致乙型血友病，表現(xiàn)為自發(fā)性或微外傷后出血不止，嚴重者可因關(guān)節(jié)出血而導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形和殘廢或因內(nèi)臟或顱內(nèi)出血而死亡。

人血漿來源凝血因子Ⅸ制劑 (Mononine，ZLB公司) 于2000年由美國FDA批準上市。Mononine通過免疫親和層析純化，對于乙型血友病具有良好的治療效果和安全性[46-47]。

重組人凝血因子Ⅸ (rhFⅨ) 于 1997年由美國FDA批準上市，由Genetics Institute和Wyeth公司研制，商品名為BeneFIX。BeneFIX由通CHO細胞株生產(chǎn)，具有較好的治療效果，能夠增加血漿中FⅨ的水平，糾正病人的凝血缺陷[48-49]。

4.7 凝血酶原復(fù)合物

凝血酶原復(fù)合物 (Prothrombin complex concentrate，PCC)，由凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ組成，此4種凝血因子均為維生素K依賴性因子，理化性質(zhì)相近，在規(guī)模生產(chǎn)過程中一般的方法很難將其分開。PCC在臨床上主要用于乙型血友病及維生素K缺乏或患肝病而引起的出血治療。

PCC制備的原料主要為新鮮冷凍血漿、去冷沉淀的血漿和低溫乙醇法分離出的組分Ⅰ上清或組分Ⅲ沉淀。1971年Bruning等[50]報道用氫氧化鋁吸附制備PCC，隨后Wickerhauser、Heystek等[51-52]采用DEAE-cellulose、DEAE-Sephadex A50等陰離子交換劑制備PCC。

4.8 活化凝血酶原復(fù)合物

活化凝血酶原復(fù)合物 (Activated Prothrombin Complex Concentrate，APCC) 主要用于存在FⅧ抑制物的血友病病人的治療，于20世紀70年代開發(fā)上市?！盎罨疨CC”和內(nèi)含肝素對已產(chǎn)生抑制物的血友病病人有一定的效果。APCC止血的確切機制尚不清楚，可能與繞過FⅧ的旁路凝血反應(yīng)有關(guān)。

1980年美國Hyland公司的APCC Autoplex獲得 FDA的生產(chǎn)許可，1982年 Immumo公司的FEIBA由FDA批準上市。但是，APCC在臨床應(yīng)用中有潛在血栓形成的風險，使用過程中應(yīng)對患者進行監(jiān)測。

4.9 因子Ⅺ

凝血因子Ⅺ (FⅪ) 由2個相同的亞單位組成的二聚體，亞單位間由二硫鍵相連。在凝血過程中，被活化的因子Ⅻ激活，進一步激活因子Ⅸ，促進凝血。FⅪ缺乏會導(dǎo)致丙型血友病。

FⅪ的規(guī)模化制備方法通常有兩種：一是以去冷沉淀血漿為原料，經(jīng)過 DEAE-cellulose和 heparin–Sepharose兩步層析，再進一步純化獲得FⅪ；二是以血漿為原料，經(jīng)過陰離子和陽離子交換層析獲得FⅪ。

Burnouf-Radosevich等[53]以血漿為原料，通過過濾吸附和陽離子交換層析制備FⅪ，該FⅪ具有高比活性 (130~150 U/mg) 和高效價 (約100 U/mL)。

4.10 因子ⅩⅢ

凝血因子ⅩⅢ (FⅩⅢ) 是由2個α亞單位和2個β亞單位組成的四聚體，活性中心位于α亞單位。在凝血過程中，F(xiàn)ⅩⅢ催化相鄰的纖維蛋白單體共價交聯(lián)，使可溶性纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿睦w維蛋白多聚體，從而形成穩(wěn)定的纖維蛋白凝塊。FⅩⅢ制品主要用于先天性FⅩⅢ缺乏。

血漿來源 FⅩⅢ的制備原料有血漿和胎盤血。Winkelman等[54]報道了利用血漿分級分析、色譜純化等步驟獲得 FⅩⅢ的方法。Backer等[55]報道了以人胎盤血為原料經(jīng)過乙醇沉淀、DEAE-Cellulose以及分子篩等步驟制備FⅩⅢ的方法。

重組來源 FⅩⅢ也處于研究之中，Board等[56]開展了在大腸桿菌中表達 rFⅩⅢ的研究，Bishop等[57]嘗試在酵母中表達rFⅩⅢ，取得一定的進展。針對FⅩⅢ缺乏患者開展的Ⅰ期臨床試驗結(jié)果表明，rFⅩⅢ與血漿來源的 FⅩⅢ具有相似的半衰期，還有較好地促進凝固能力和抵抗纖維蛋白降解的能力。

5 微量血漿蛋白成分

近年來，隨著分離技術(shù)的進步，特別是離子交換層析和親和層析的應(yīng)用，血漿中的許多少量或微量蛋白成分被分離提純，用于治療先天或后天缺乏這些蛋白所導(dǎo)致的疾病。因此，微量血漿蛋白成分已經(jīng)成為血液制品研究的熱點之一。

5.1 蛋白C

人蛋白C (Protein C，PC) 是存在于血漿中的絲氨酸蛋白酶前體，由肝細胞合成，血漿中的正常濃度為4 mg/L，是抗凝系統(tǒng)的主要成分。內(nèi)皮細胞膜上的凝血酶-凝血調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物激活PC后，生成抗凝劑活化蛋白C (aPC)[58]。aPC能降解活化的凝血因子Va和Ⅷa，減弱其促凝活性。aPC還在感染性疾病，特別是嚴重膿毒血癥、內(nèi)毒素血癥和彌散性血管內(nèi)凝血 (DIC) 等治療中起到了很好的作用。

自從1976年Stemflo等[59]從牛血清中純化得到PC以來，其臨床效果已經(jīng)得到認可。歐盟與美國分別于2001年和2007年批準了奧地利Baxter公司的蛋白C制品Ceprotin。該產(chǎn)品采用鼠源單抗法對血漿中的PC純化獲得，濃縮超過20 000倍，濃縮物無蛋白水解活性，體內(nèi)外試驗未發(fā)現(xiàn)其具有潛在的血栓形成能力，可用于蛋白C缺乏病人的紫癜爆發(fā)、香豆素引起的皮膚壞死及嚴重蛋白C缺乏患者的短期預(yù)防。

重組人活化蛋白 C (商品名為 Xigris) 由 Eli Lilly公司生產(chǎn)，先后于2001年和2002年獲準在美國、歐盟批準上市。Xigris是一種絲氨酸蛋白水解酶，氨基酸序列和糖基化位點與人血漿來源的aPC相同，其作用可以緩解膿毒血癥的多種主要癥狀，包括血液凝結(jié)和促進纖維蛋白溶解。重組人活性蛋白C治療重度膿毒血癥的Ⅲ期臨床研究結(jié)果表明，Xigris使重度膿毒血癥病人的死亡風險降低了近20%[60]。本實驗室在近年來也開展了重組蛋白C的研究。經(jīng)過鑒定，由HEK293細胞表達的重組蛋白C具有與血漿白C一致的生物學(xué)功能。目前我們對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以期提高表達量[61]。

5.2 抗凝血酶

抗凝血酶 (Antithrombin，AT) 是體內(nèi)重要的抗凝物質(zhì)之一，占血漿總抗凝酶活性的 50%~60%，血漿中的含量為0.1~0.2 g/L。AT屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑，對凝血因子Ⅱa、Ⅹa、Ⅸa、Ⅺa以及纖溶酶、激肽釋放酶和補體均有滅活作用，在維持機體的出凝血平衡中起重要作用。因此，AT制品適用于有先天性或獲得性缺乏所致的靜脈血栓和肺栓塞。

AT濃縮劑的臨床試用開始于20世紀70年代。近年來，使用肝素親和層析法從血漿中提取、純化的AT，并經(jīng)60 ℃，10 h滅活處理，制備的靜脈注射用AT濃縮制劑已在歐美等國得到較普遍的應(yīng)用。該制劑可用于治療先天性或獲得性AT缺乏癥，如肝病或口服避孕藥后引起的AT水平降低、DIC或一些血栓性疾病的預(yù)防和治療。

英國的Genzyme Transgenics公司利用轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)的重組AT (ATryn)，先后于2006年和2009年經(jīng)歐盟和美國批準上市，用于先天性抗凝血酶缺乏患者術(shù)前預(yù)防靜脈血栓形成，而作為圍產(chǎn)期婦女的預(yù)防和治療效果目前處于臨床研究階段。

5.3 α1-抗胰蛋白酶

α1-抗胰蛋白酶 (α1-antitrypsin，α1-AT) 是血漿中最重要的蛋白酶抑制劑，血漿總蛋白酶抑制活性的 70%來源于 α1-AT，其在正常人血清中的濃度為1.8~2.8 g/L。α1-AT的生理功能主要是平衡出凝血系統(tǒng)和調(diào)節(jié)激肽系統(tǒng)；作為一種急性期蛋白，它還能夠抑制蛋白水解酶對組織的破壞。α1-AT缺乏的直接相關(guān)疾病主要是肺氣腫和肝硬化，可使用 α1-AT替代治療，以恢復(fù)病變組織的彈性蛋白酶-抗彈性蛋白酶的平衡。

以低溫乙醇法分離組分上清為原料，是制備α1-AT濃縮制品的常規(guī)方法。Chen等[62]利用陰離子、陽離子交換層析、TNBP-膽酸鹽處理的方法獲得了高純度的 α1-AT，最終產(chǎn)品的純度近 95%，活性＞90%，收率＞70%，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。Bayer公司生產(chǎn)的血漿來源的α1-AT (Prolastin) 在1987經(jīng)美國FDA批準上市；Alpha Therapentic公司和 Aventis Behring公司生產(chǎn)的α1-AT濃縮制劑也于2003年獲準上市。

此外，重組 α1-AT已經(jīng)在許多細胞和生物體得到成功表達。Nada等[63]已在煙草中獲得高表達的重組α1-AT；Flotte等[64]構(gòu)建出腺病毒α1-AT重組質(zhì)粒，將其肌肉注射給α1-AT缺乏患者，該試驗已于2010年7月進入Ⅱ期臨床試驗；2010年2月，Arriva公司研制的重組 α1-AT噴霧制劑，已經(jīng)通過Ⅰ期臨床試驗，結(jié)果顯示該制劑在治療由 α1-AT缺乏導(dǎo)致的肺纖維化時，具有很好的安全性和免疫原性，并且該藥物直接作用于肺部組織，因此所需治療劑量遠遠低于血漿來源的制品。

5.4 組織纖溶酶原激活劑

組織纖溶酶原激活劑 (Tissue plasminogen activator，tPA) 由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，血漿中的濃度為 4.0±1.8 mg/L。tPA可使纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶，纖溶酶水解纖維蛋白凝塊 (纖維蛋白性血栓) 成為纖維蛋白降解產(chǎn)物，從而使血栓得到溶解。因此，tPA可用于急性心肌梗塞、肺梗塞和其他血栓傾向的治療。

由于tPA在血漿中的含量極少，通過血漿純化的方法提取是不現(xiàn)實的。1987年美國 Genetech公司用 CHO細胞生產(chǎn)的 tPA重組制劑“Active Alteplase”成為第一個被美國 FDA批準的動物細胞大規(guī)模生產(chǎn)的基因工程產(chǎn)品，其特異活性達到550 000~667 000 IU/mg。但重組tPA存在的主要缺點是半衰期很短，因此研究者基于分子結(jié)構(gòu)原理，運用定點突變的手段來實現(xiàn)缺失某一結(jié)構(gòu)或功能域，或者復(fù)制特異區(qū)域，進而增加tPA的專一性和體內(nèi)的半衰期[65]。

5.5 α2-巨球蛋白

α2-巨球蛋白 (α2-macroglobulin，α2-MG) 分子量約為800 kDa，是血漿中分子量最大的蛋白質(zhì)，在血漿中的含量約1~3 g/L。α2-MG是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，具有清除血液循環(huán)中外源性蛋白酶、維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定的重要作用。由于α2-巨球蛋白能夠增強骨髓產(chǎn)生白細胞的能力，因此多用于防治放射性損傷，對放射治療引起的潰瘍病人有促進傷口愈合的功能；另外，α2-MG對組織腫瘤生長還具有抑制作用。

α2-MG可由人血清、胎盤血、Cohn組分Ⅲ或組分Ⅳ中制備?？捎昧蛩徜@、乙醇沉淀等沉淀法先進行粗提，隨后再經(jīng)離子交換樹脂進行進一步的純化。由于α2-MG是大分子蛋白質(zhì)，因此在純化的最后階段，一般都采用合適的凝膠介質(zhì)，如葡聚糖 G-200等進行凝膠過濾，α2-MG可在流過緩沖液中收集。

5.6 補體脂酶抑制劑 (C1-抑制劑)

C1-抑制劑 (C1-esterase inhibitor，C1-INH) 是一種在肝臟中合成的單鏈糖蛋白，血漿含量為 180~ 350 mg/L，對補體、凝血、纖溶、激肽四大系統(tǒng)均有抑制作用，能夠滅活已激活的補體C1r和C18、內(nèi)源性凝血因子Ⅺa、FⅫa及激肽釋放酶，對纖溶系統(tǒng)的纖溶酶和 t-PA也有滅活作用。遺傳性缺乏C1-INH 可引起血管水腫，因此需要用特異性的C1-INH制劑進行補償療法[66]。

Poulle等[67]報道了用兩步層析法來純化C1-INH。去除冷沉淀的血漿經(jīng)陽離子交換介質(zhì)和SO3 Francto gel EMD層析，每升血漿中可以得到60~70 mg的C1-INH。在加拿大獲準上市的C1-INH濃縮劑“Berinet P”經(jīng)過近30年的臨床應(yīng)用，證明是安全有效的。由Pharming和Baxter公司共同研制的重組人C1-INH分別獲得美國FDA和歐盟EMEA批準上市，用于治療遺傳性血管性水腫。

5.7 其他微量血漿蛋白

血清膽堿酯酶 (Serum cholinesterase，CE) 為一種?；饷?，對含膽堿的酯有極強的催化水解作用。法國國家輸血中心和德國的Behringwerke公司以Cohn組分Ⅳ為原料，分離血清膽堿脂酶，制品相當于將血漿200倍濃縮，治療有機磷中毒和琥珀酰膽堿麻醉后過長窒息的急救等具有明顯的臨床功效，已作為正式的產(chǎn)品供應(yīng)市場。

補體系統(tǒng)Ⅰ因子是一種肽鏈內(nèi)切酶，能裂解結(jié)合于細胞表面或存在于血漿中的C3b分子的α鏈，使其失去活性，從而實現(xiàn)對補體激活系統(tǒng)經(jīng)典途徑和替代途徑的調(diào)節(jié)作用。先天性 I因子缺乏將會導(dǎo)致機體不能發(fā)揮其正常的抗感染等防御作用，因此常發(fā)生嚴重的復(fù)發(fā)性感染，需輸注血漿純化的Ⅰ因子制劑，以糾正患者的補體功能。

轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Transferrin，Tr) 是一種分子量為765 kDa的糖蛋白，血漿濃度為0.2~0.5 mg/L，能夠附著于細胞膜表面，有利于鐵的生理轉(zhuǎn)換。此外Tr還能滅活鐵的毒性作用，參與鐵吸收的調(diào)控。Tr可由Cohn氏組分Ⅳ作為起始原料進行純化，在治療兒童急性白血病及鐵中毒有一定療效，但迄今未作進一步推廣，僅作為試劑用于無血清細胞的培養(yǎng)。

銅藍蛋白 (Ceruloplasmin，Cp) 由于結(jié)合 Cu2＋并成藍色而被命名，是一種氧化酶，在有氧存在的條件下，可促進多種化合物的氧化活性。Cp在體內(nèi)參與銅和鐵的代謝，遺傳缺乏可導(dǎo)致肝豆狀核變性(威爾遜氏病)。以 Cohn氏組分Ⅳ或分離凝血酶原復(fù)合物的亞組分為原料，可獲得濃縮的 Cp。由于其臨床作用有待于進一步研究，因此 Cp至今未見臨床應(yīng)用。

纖維結(jié)合蛋白 (Fibronrctin，F(xiàn)n) 是存在于細胞表面和血漿中的高分子糖蛋白。該蛋白具有廣泛的生物學(xué)活性，除能促進單核-巨噬細胞系統(tǒng) (RES)的吞噬作用外，還參與細胞的各種活動，并在組織修復(fù)中起重要作用。采用肝素親和層析法，可以從血漿或冷沉淀中提取、純化 Fn。靜脈輸注 Fn可以增強機體的RES功能；局部外用促進細胞的黏附、生長和傷口愈合，但其作用尚需進一步臨床研究。

高密度脂蛋白 (High density lipoprotein，HDL)是由蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合而成的復(fù)合蛋白質(zhì)，在肝臟和小腸中合成，是血漿脂蛋白家族中重要的成員。HDL粒子中的蛋白質(zhì)和脂類各占約50%，含有少量的糖類；其中的蛋白質(zhì)稱為載脂蛋白，在脂類傳遞中起著重要作用。HDL功能的研究推動了應(yīng)用研究，CSL公司開發(fā)的重新組合的HDL用于急性冠脈綜合征，已經(jīng)完成臨床試驗。

6 發(fā)展趨勢與未來展望

通過以上對血漿蛋白與重組血漿蛋白制品現(xiàn)狀的簡要介紹可以看出，血液制品或血漿蛋白產(chǎn)品既是一個傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，也是一個新興產(chǎn)業(yè)?，F(xiàn)代生物技術(shù)，特別是基因重組技術(shù)和制備工藝的發(fā)展，為血液制品的研發(fā)提供了更為廣闊的空間。

6.1 血漿來源的制品仍將具有其不可替代的特殊地位

血液是人類賴以生存的命脈，血液與血液制品具有醫(yī)療產(chǎn)品和藥品的雙重特性，具有其他藥物無法比擬和替代的優(yōu)點。全球性的醫(yī)用血源緊張已成為各國醫(yī)療機構(gòu)所面對的難題，新型血液成分制品、血漿蛋白制品的制備與鑒定技術(shù)已經(jīng)成為藥物研制和開發(fā)的重要組成部分，甚至是衡量一個國家或地區(qū)發(fā)達程度的指標之一。

隨之血漿蛋白制品制備過程中病毒滅活工藝的增加、GMP的強制執(zhí)行和產(chǎn)品注冊要求的提高，使得人們以往擔心的傳播病毒性疾病的可能性已經(jīng)降至最低。多年的臨床實踐表明，幾乎未能發(fā)現(xiàn)人血白蛋白傳播病毒性疾病的病例。同時，靜脈注射免疫球蛋白制品已經(jīng)成為歐洲某些國家的家庭用藥。可以認為，血漿蛋白制品已經(jīng)成為最為安全的藥品之一[68]。

鑒于重組技術(shù)及其產(chǎn)品的局限性和血源性制品的特殊性，在可以預(yù)見的將來，重組產(chǎn)品完全取代血源性制品幾乎沒有可能。

6.2 血漿蛋白新品種的研發(fā)仍是熱點

傳統(tǒng)工藝與現(xiàn)代技術(shù)的結(jié)合、改進與完善，使得血漿蛋白新制品不斷出現(xiàn)，使以往因為技術(shù)和成本限制的微量蛋白制品的研發(fā)成為可能，一份血漿制備多達十幾種不同產(chǎn)品已在領(lǐng)先的血液制品企業(yè)實施[69]。

當今新發(fā)傳染病時有發(fā)生以及生物戰(zhàn)劑與生物恐怖的潛在威脅，特異性免疫球蛋白在未來將會發(fā)揮更大的作用，用作烈性傳染病應(yīng)急預(yù)防和治療的特異性免疫球蛋白，諸如抗天花病毒免疫球蛋白、抗SARS免疫球蛋白、抗炭疽血清等應(yīng)該成為各國的常規(guī)貯備制品[70]。

特異性免疫球蛋白不斷問市，加之免疫球蛋白的新使用途徑和適應(yīng)癥的不斷擴展，使得人源免疫球蛋白制品的研發(fā)始終保持著旺盛不衰的勢頭。

6.3 重組血漿蛋白制品正在迅速發(fā)展

自從1992年美國FDA 批準第一代rhFⅧ產(chǎn)品Recombinate，重組血漿蛋白制品已經(jīng)走過了將近30個年頭。隨后，多個廠家和不同制品在世界許多國家和地區(qū)獲得了注冊。鑒于 rhFⅧ制品的巨大需求，目前仍有諸多企業(yè)正在進行研發(fā)或新一代產(chǎn)品改進[10]。

HSA是迄今為止產(chǎn)量最大、用量最多的血漿蛋白藥物，在臨床和生物產(chǎn)品中的廣泛應(yīng)用使其在國內(nèi)外均具有很大市場。隨著輸注用重組白蛋白的問世，彌補了血漿來源白蛋白的諸如原料血漿價格上漲、病毒滅活過程增加等缺陷。由于 rHSA批次之間的產(chǎn)品均一度好、純度高、生產(chǎn)規(guī)模不受限制、無病毒傳播風險，從而賦予其巨大的市場前景。

隨著重組凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ、人蛋白C以及轉(zhuǎn)基因動物來源的抗凝血酶Ⅲ和α1-抗胰蛋白酶等的上市，既給傳統(tǒng)血液制品企業(yè)提出了挑戰(zhàn)，也為血液制品企業(yè)帶來了機遇。目前，重組血漿制品的研發(fā)重點在于解決生產(chǎn)力不足、使重組藥物結(jié)構(gòu)更加合理化以及給藥途徑的多樣化。盡管面臨種種挑戰(zhàn)，但隨著市場的發(fā)展和臨床需求的不斷增加，相信其必將有廣闊的發(fā)展空間[71]。

6.4 我國血液制品的研發(fā)與國外存在著較大的差距

血漿綜合利用率低、上市品種少是我國血液制品行業(yè)的現(xiàn)實，與發(fā)達國家，特別是國際血漿蛋白治療協(xié)會 (PPTA) 的成員企業(yè)相比存在著較大的差距。

國內(nèi)多大企業(yè)仍然沿用傳統(tǒng)的低溫乙醇工藝，而歐美企業(yè)普遍對傳統(tǒng)工藝進行了改良，同時引入了層析工藝，使得其相關(guān)血液制品的產(chǎn)品質(zhì)量高、產(chǎn)品品種多。國外已經(jīng)上市或正在進行臨床試驗的血漿蛋白產(chǎn)品有近30種，國內(nèi)超過10種的企業(yè)只有1家，一般企業(yè)均不足10種，甚至不足4種，這也使得國內(nèi)血液制品企業(yè)的百噸效益明顯較低。

可喜的情況是，我國部分企業(yè)已經(jīng)認識到了差距的存在，正在加速新產(chǎn)品的研發(fā)和制備工藝的改進。

6.5 我國血液制品企業(yè)面臨著機遇與挑戰(zhàn)

縱觀近年來國際血漿蛋白制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，市場競爭日益激烈，全球一體化似乎是一大發(fā)展趨勢，血漿白蛋白的進口已經(jīng)對我國血液制品行業(yè)產(chǎn)生了很大的沖擊。

我國現(xiàn)有30余家血液制品企業(yè)的規(guī)模較小，年投漿量不及澳大利亞的CSL公司，存在著嚴重血漿短缺問題。2006年，全國總投漿量不到5 000噸，近兩年的投漿量更少，而CSL公司的2005年投漿量接近6 000噸。目前，年血漿加工能力在2 000噸以上的制造商主要是血漿蛋白治療協(xié)會 (PPTA) 的會員，其中CSL、Bayer Biologicals、Baxter、Grifols等陸續(xù)成為跨國集團，全球血漿蛋白制造企業(yè)的數(shù)量不斷減少。我國血液制品企業(yè)的整合也已或即將成為不爭的事實。

我國政府高度重視血液制品行業(yè)的監(jiān)管，出臺了一系列整頓整治政策法規(guī)，包括適當限制進口(人血白蛋白除外)、不再批準新血液制品企業(yè) (2001年起)、單采血漿站的“GMP”認證、窗口期制度等等，這些措施有利于我國血液制品市場的凈化和長期健康發(fā)展。目前，原料血漿的短缺問題正在逐步改善，血漿資源向優(yōu)勢企業(yè)集中也將是一個必然的發(fā)展趨勢。

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