梁紅茹，楊松濤，張濤，胡桂秋，夏咸柱

1 吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，長春 130062

2 軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130062

早在1988年至1989年，按照生物化學性質從人工合成的核苷酸庫中分離篩選核苷酸就已經有廣泛的報道。1990年，Robertson等通過親和層析的方法從人為構建的 RNA文庫中篩選到能夠高特異性和高親和力地結合小分子ATP的RNA序列，此段序列即為適配體[1]；同年，Tuerk等在試驗室成功地從帶有8個隨機序列的RNA文庫中篩選出可特異性結合噬菌體T4 DNA聚合酶的序列[2]。

適配體 (Aptamer) 是一種經體外篩選技術得到的寡核苷酸序列 (RNA或 DNA)，與相應的配體有嚴格的識別能力和高度的親和力[3]，大小一般約6~40 kDa。單鏈寡核苷酸，特別是RNA的一些二級結構，如發(fā)夾、莖環(huán)、假節(jié)、凸環(huán)、G-四聚體等，可使核酸分子形成多種三維結構，成為適配體與靶物質特定區(qū)域結合的基礎，二者之間的結合主要通過“假堿基對”的堆積作用、氫鍵作用、靜電作用和形狀匹配等產生高特異性的結合力。適配體具有高特異性、靶分子廣、易于體外合成和修飾等優(yōu)點，已經在基礎研究、臨床診斷和治療中顯示了廣闊的應用前景。本文主要對于適配體的基本特點及其在微生物學中的應用進行綜述。

1 核酸適配體的特點

大量適配體的結構已經通過酶學或化學探測，原子核磁共振 (NMR) 和X衍射探測確定。由于它們的分子量相對比較小，NMR方法相對更加適合檢測適配體的結構。

1.1 適配體的大小

大多數情況下，應用的適配體應盡可能的小，以使成本更低，可以更容易和靶標結合等。因為功能RNA折疊能力是有限的，適配體的最小長度通常比可控的空間序列大，而且，從體外篩選過程最初得到的適配體約50個堿基，包括用于擴增和轉錄的兩側固定序列區(qū)和中間隨機序列。重組缺失分析、印記和體外合成法可以用于確定綁定于靶標所需的最短核苷酸的大小。最小的適配體長度范圍相當廣泛，例如在血管內皮生長因子內最小的長度在23~35個堿基；最小的黃嘌呤和鳥嘌呤配體有32個堿基；鏈霉素配體有46個堿基；與血液絲氨酸蛋白酶 (蛋白C) 結合的最小部分配體可達99個堿基。適配體分子量的范圍在 7.5~32 kDa，一般標準大小是10 kDa，標準適配體的暴露面積一般為50~60 nm2。

1.2 適配體的靶標物質

大量的體外篩選已經表明篩選出的適配體可以特異地結合任何靶標，包括小的離子 (例如Zn2+)、核苷酸 (例如ATP)、肽、大的糖蛋白 (例如CD4)、病毒粒子、細胞、甚至組織[4]，結合的靶標的大小可以為65 Da到150 kDa，理論上沒有上限。

適配體結合靶標有一定的特點：1) 適配體綁定蛋白質的位點有一定的偏嗜性，大量報道表明適配體結合于蛋白質的多聚陰離子位點，例如核酸或者葡糖氨基聚糖類，包括凝血酶和其他凝血級聯中的蛋白酶、大量的肝素結合生長因子、細胞轉錄因子、病毒調節(jié)蛋白等；2) 適配體即使為不同的結構，它們在大蛋白上的結合位點有高度的相似性。例如，研究發(fā)現 6種針對血管內皮生長因子的適配體都結合在相同的區(qū)域，它們與肝素和其他天然配體競爭結合并交聯與同一個半胱氨酸，4個結構不同的適配體與反轉錄酶結合在同一位置。例如用3種RNA庫，不同的篩選程序，不同的篩選方法針對 HIV-1的逆轉錄酶篩選的適配體，它們都具有假結結構并且都綁定于酶的相同位點[5]。

1.3 適配體的親和力

已報道的適配體和靶標的親和力變化范圍很大，一般和小分子的親和力相對比較低，例如適配體與氨基酸結合，如瓜氨酸和精氨酸，親和力范圍在0.3~65 μmol之間；與ATP、黃嘌呤結合的親和力分別為6 μmol、3.3 μmol；與多巴胺結合的親和力是2.8 μmol；與維生素B12結合的親和力是9.0 nmol；適配體與典型核酸分子結合的親和力在納摩爾范圍，適配體與反轉錄病毒整合酶結合的親和力為 10~800 nmol；與反轉錄酶結合的親和力為0.3~20 nmol；與核蛋白結合的親和力約為2 nmol；與核糖體 RNA綁定氨基酸糖苷抗生素結合親和力大約是 0.8 nmol；免疫球蛋白家族所包括的蛋白質篩選出的適配體親和力在2~40 nmol之間，這可能與免疫球蛋白和細胞表面糖蛋白的作用有關。

1.4 適配體的特異性

研究發(fā)現與靶標有高親和力的適配體多數可以表現為高特異性，可以區(qū)別有相似酶活性的不同酶類，例如區(qū)分α-凝血酶和γ-凝血酶；區(qū)分貓免疫缺陷病毒和其他 3種反轉錄病毒的反轉錄酶；區(qū)分僅僅有23個殘基不同的蛋白激酶C的同工酶；區(qū)分結構僅僅是1個甲基的差別的咖啡因和茶堿。

然而，適配體也只是在一定程度上具有特異性，有時也可以非特異地識別非靶標物質。例如輔酶A的適配體也能夠識別 AMP；識別黃嘌呤的適配體可以識別鳥嘌呤，但是不能識別腺苷胞嘧啶或尿嘧啶。

2 核酸適配體的篩選方法

適配體的體外篩選過程稱為指數富集配體系統(tǒng)進化技術 (Selective expansion of ligends by exponential enrichment，SELEX)，指模擬自然進化人工篩選技術，首先體外化學合成一個隨機堿基數為n的單鏈寡核苷酸文庫，該文庫則含4n個不同的寡核苷酸序列，常用的寡核苷酸隨機序列含30個堿基，庫容量高達 430(1018)；隨機序列的兩端為隨后PCR循環(huán)時結合引物所必需的固定序列，由于這種隨機序列，而決定了庫中每條鏈自然形成的空間構象，即二級結構的多樣性，決定了庫中潛在地存在能與各種蛋白和低分子靶物質有親和力的核酸配體[6]。一般篩選文庫的容量巨大 (可達 1015左右)，理論上應用 SELEX技術能篩選到自然界幾乎所有靶分子的適配子[7]。

篩選過程包含和達爾文進化理論一樣的 3個過程，分別是自發(fā)突變、自然選擇、大量增殖，一般包括幾輪篩選，每輪循環(huán)包括3個主要步驟：1) 寡核苷酸庫和靶標分子孵育；2) 寡核苷酸復合物和未結合的寡核苷酸分離；3) 結合的序列用PCR擴增[8]，再進入下輪的篩選過程，通過重復的篩選與擴增那些與靶物質不結合或與靶物質有低親和力、中親和力的DNA或RNA分子被洗去，而與靶物質有強親和力的DNA或RNA分子從非常大的隨機庫中分離出來且純度隨SELEX過程的進行而增高，從pmol到nmol，有的甚至到μmol，最后占據庫的大多數 (＞90%左右)[9]，隨著寡核苷酸庫的逐漸富集對靶標的親和性增加。一般經過6~15次的循環(huán)就可以獲得特異性的適配體。

3 核酸適配體在病毒方面的應用

SELEX技術發(fā)展至今，已針對廣泛類型的病毒靶分子如逆轉錄酶、解螺旋酶、核衣殼蛋白和調節(jié)因子等篩選出了各自的適體。

目前 SELEX技術已經被廣泛地應用到臨床醫(yī)學的各項研究領域當中，包括疾病的診斷和治療。在多種病毒病研究中顯示適配體能夠識別和結合到病毒的特定部位上，適配體可以作為功能阻斷劑直接影響病毒的復制、翻譯中特定步驟，從而中斷疾病發(fā)生；適配體也可以特異性的識別被病毒感染的細胞，從而用于診斷[10]。

3.1 在流感病毒方面的應用

流感病毒表面血凝素蛋白 (HA) 呈柱狀，能與人、鳥、豚鼠等動物紅細胞表面的受體相結合引起凝血，血凝素蛋白水解后分為輕鏈和重鏈兩部分，后者可以與宿主細胞膜上的唾液酸受體相結合，前者則可以協(xié)助病毒包膜與宿主細胞膜相互融合，血凝素是流感病毒最重要的抗原成分，也是抗體最重要的結合位點。

2004年，Jeon等篩選的 ssDNA適配體作用于HA的受體綁定區(qū)域，阻斷了病毒-宿主細胞的結合，而抑制流感病毒的感染，并且在細胞培養(yǎng)的試驗證明篩選出的適配體可以阻斷病毒感染細胞[11]。2006年，Gopinath等針對 A/Panama/2007/1999 (H3N2)株HA區(qū)域篩選出的適配體，和HA的親和性比單克隆抗體的親和性高約15倍，可以用于鑒定A型流感病毒的不同亞型，并且可以有效地抑制 HA介導的膜融合[12]。

3.2 在肝炎病毒方面的應用

肝炎病毒是指引起病毒性肝炎的病原體。甲型肝炎病毒 (HAV) 呈球形，無包膜，核酸為單鏈RNA；乙型肝炎病毒 (HBV) 呈球形，具有雙層外殼結構，外層相當一般病毒的包膜，核酸為雙鏈DNA；丙型肝炎病毒 (HCV) 是一種具有脂質外殼的RNA病毒，直徑50~60 nm，其基因組為10 kb單鏈RNA分子。

2001年，Butz等針對HBV核心抗原篩選的適配體在細胞內和 HBV核心蛋白結合，能有效地干擾病毒衣殼的形成和病毒的生成[13]。2002年，Biroccio等篩選出針對HCV亞型1a的RNA適配體[14]；2003年，Bellecave等篩選出針對HCV亞型1b的DNA適配體[15]；2006年，Tomai等篩選出針對HCV亞型3a的DNA適配體，主要作用位點是RNA依賴的RNA聚合酶，抑制聚合酶的活性，從而干擾病毒的復制[16]。2009年，Kikuchi等篩選出針對HCV的IRES區(qū)域Ⅱ的適配體，IRES對于mRNA的轉錄很重要，因此適配體通過影響病毒的轉錄，從而影響病毒的復制[17]。2006年，Fukuda等篩選出針對HCV NS3的適配體，NS3為一種多功能酶，對于HCV的復制和病毒擴增非常重要，篩選出的適配體在細胞水平上顯示能抑制病毒的繁殖[18]。

3.3 在艾滋病毒方面的應用

艾滋病，又稱獲得性免疫缺陷綜合癥 (Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，是由人類免疫缺陷病毒 (Human immunodeficieney virus，HIV) 引起的人體細胞免疫功能缺陷，導致一系列條件致病微生物感染和腫瘤發(fā)生的致命性綜合征。

研究發(fā)現，在艾滋病毒的反轉錄酶上與適配體結合的裂隙是酶與病毒模板及引物結合的部位。Pheroze等篩選針對反轉錄酶的適配體可以形成類假結結構的二級結構，細胞水平上在病毒反轉錄的早期可以有效地干擾HIV的復制，阻礙病毒基因的延伸，并且毒性很小，較少形成耐藥株。2000年Yamamoto等篩選的針對Tat蛋白的RNA適配體，可以明顯抑制 HIV的活性，在細胞水平上可以使HIV-1的復制減少70%[19]。

3.4 細胞-SELEX病毒方面的應用

病毒感染時，在復制、組裝、釋放過程中，病毒蛋白會插入到細胞的表面從而修飾細胞表面成分，細胞這種表面的改變或者產生的標志物使細胞產生特異性的抗原，因此針對這種特異性的抗原設計探針可以檢測病毒感染的細胞。而且，病毒感染細胞產生的標志物在未知的情況下，也可以用SELEX技術篩選出適配體，而這種識別特異性靶標的適配體一旦篩選出可以用于檢測病毒感染的細胞。2009年，Tang等利用細胞-SELEX技術，篩選出識別牛痘病毒感染的A549細胞的適配體，它不僅識別病毒感染細胞，而且識別細胞質膜上病毒修飾成分[28]。

4 核酸適配體在細菌方面的應用

4.1 在細菌檢測方面的應用

適配體檢測抗原是近年來發(fā)展起來的新技術，將一個適配體末端交聯到固相載體上作為捕獲分子，去捕獲待測標本中的靶物質，另一個適配體的5′端標有相應的指示劑，如熒光素、生物素、放射性同位素或膠體金等標記轉化為檢測分子，當檢測分子與相應的待測標本結合后就會產生信號，以達到檢測的目的。

結核分枝桿菌的基因編碼的早期分泌蛋白ESAT-6，僅存于結核桿菌和少數幾種非結核桿菌中，而所有的分支桿菌卡介苗菌株和非致病性分支桿菌中均缺失該基因，因此ESAT-6作為區(qū)分MTB感染和卡介苗接種或環(huán)境分枝桿菌感染的特異性抗原，2007年，馬占忠等以 ESAT-6為靶蛋白，通過SELEX技術篩選獲得ESAT-6的適配體，為結核病診斷和治療試劑的開發(fā)奠定基礎[21]。2010年，蔡江麗等獲得結核分枝桿菌分泌蛋白 64抗體的適配體并進行血清學檢測方面的研究[22]。2004年，潘勤等針對preppilS蛋白運用SELEX篩選特異親和傷感桿菌WB型纖毛的RNA適配子，并進行了初步RNA適配子庫的親和力以及生物學作用的檢測，為進一步研究傷寒桿菌的致病機制和預防、治療傷寒熱癥的新型藥物提供了基礎[23]。

現在研究認為細菌是一個含有多種成分的復合物，以整個細菌作為靶分子進行篩選就可以在未知細菌的內部結構、功能的情況下篩選出與其特異性結合的一組適配體，與單個適配體相比，一組特異性的適配體必定能提高檢出的敏感性和特異性；更重要的是組合應用能夠提高適配體的通用性。

4.2 在細菌治療方面的應用

雖然SELEX技術的研究應用依然在初級階段，但是適配子作為直接蛋白配體、抑制劑以及臨床疾病的治療藥物已展現出潛在的應用前景，SELEX技術出現 8年后就已經有應用于臨床試驗的產品。適配體可以直接結合于靶物質表位，使病原不能和機體結合而使疾病得到控制。因此在理論上，適配體可以被用于治療任何由有害基因的表達而引起的疾病，例如細菌感染、病毒感染、炎性疾病等。

2008年，楊清武等為獲得內毒素 (LPS) 的抑制性適配子運用于臨床膿毒癥的防治，建立了從隨機單鏈 DNA (ssDNA) 文庫篩選寡核苷酸的適配子的 SELEX技術平臺，為后續(xù)的治療性研究提供了平臺[24]。

適配體折疊后形成的特定三維結構能與生物靶標如蛋白質結合，因此適配體可以直接作為蛋白配體，占據了致病因子的靶物質表位，從而控制疾病的發(fā)生。

5 其他

原生動物錐蟲cruzi是導致Chaga病的病原蟲，這種疾病通常侵犯神經系統(tǒng)和心臟，未經治療的死亡率很高。針對錐蟲成蟲期的RNA適配子能夠使平均受侵害的細胞中的錐蟲數目呈劑量依賴方式減少。1 μmol/L的適配子能夠抑制50%~70%的錐蟲的入侵。

此外，適配體可以作為分子探針用于很多疾病的診斷，例如通過篩選出特異性的適配體，可以用于腫瘤的診斷。

6 展望

適配體自問世以來取得了令人鼓舞的進步，特別是一些SELEX衍生技術的發(fā)展，使核酸適配體作為診斷和治療藥物的想法逐漸變?yōu)槭聦?，迄今已有適配體藥物進入臨床前期或臨床期試驗，并逐步成為一類新型藥物。Merck Serono的董事 Bernhard Kirschbaum認為 Aptamers將在下一代的治療藥物中起著非常關鍵的作用。

2004年末，Pifzer和Eyetech公司共同研制的用于治療濕性老年黃斑變性的核酸適配子藥物“Macugen”(又名Pegaptanib) 在美國被批準上市，適配子在治療方面的研究越來越深入。Aptamera公司研制的 AGRO100是一種新型的核酸適體藥物，臨床前試驗表明 AGRO100可在癌細胞表面與Nucleolin結合，抑制癌細胞 DNA的復制并誘導細胞凋亡，并對多種癌細胞均有抑制作用，如肺癌、宮頸癌、惡性黑色素瘤及白血病等，該藥已于2003年第3季度進入Ⅰ期臨床試驗。

適配體作為一種新型的核酸藥物正迅速發(fā)展，但是也存在一些不足之處，例如適配體雖然能與靶分子高親合強特異性結合，但它難以穿透細胞膜與靶分子接近；適配體的半衰期大多較短。為了克服適配體難以接近和穿透靶組織的缺點，位點特異的傳遞系統(tǒng)成為藥物合成研究的熱點，而采用基因治療的方法，構建重組病毒然后在體內表達外源的RNA適體也成為一種新思路。相信隨著適配體研究的深入，以及適配體篩選制備技術水平的提高，以上問題將逐步得到解決。而且由于適配體的高特異性、高親合力、可修飾性，它不但在疾病的治療診斷上有十分廣闊的前景，而且在人類基因組學、蛋白組學的研究中也將成為極為重要的研究工具之一。

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