王鳳芹，劉 芳，孟 勇，王道營，諸永志，徐為民,*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(南京)，江蘇 南京 210017)

TLC和HPLC法相結(jié)合分析鹽水鴨中的生物胺

王鳳芹1，劉 芳1，孟 勇2，王道營1，諸永志1，徐為民1,*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(南京)，江蘇 南京 210017)

應(yīng)用薄層層析(TLC)和高效液相色譜(HPLC)兩種方法分析鹽水鴨中生物胺的組成及含量。薄層層析結(jié)果顯示，鹽水鴨樣品中存在著腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、酪胺和2-苯乙胺；利用高效液相色譜法也檢測到了以上6種生物胺，且各生物胺的含量均在204μg/g以下。兩種方法結(jié)果相吻合，TLC法可以作為肉制品中生物胺定性分析的一種經(jīng)濟便捷的方法。

鹽水鴨；生物胺；薄層層析(TLC)；高效液相色譜(HPLC)

生物胺是一類低分子質(zhì)量的含氮化合物，通常存在于動植物體及食品中，主要有組胺、腐胺、尸胺、色胺、精胺、亞精胺、酪胺及2-苯乙胺8種。食品中的生物胺主要通過具有脫羧酶活性的微生物的脫羧作用形成，當以食品為介質(zhì)被人體過量攝入后，會引起一系列不良癥狀[1]。對食品中生物胺的含量進行檢測，確定生物胺來源的具體微生物，將為產(chǎn)品的安全控制提供重要的理論基礎(chǔ)。

鹽水鴨獨特的感官特性決定其熟化和殺菌溫度不能超過90℃[2]，因此產(chǎn)品中必然殘存些微生物。這些殘存的微生物不僅使得鹽水鴨腐敗變質(zhì)[3]，也可能產(chǎn)生多種胺類物質(zhì)。目前食品中生物胺的研究多集中在發(fā)酵類肉制品上[4]，而有關(guān)低溫禽肉制品中生物胺的研究報道較少。本實驗采用薄層層析(TLC)與高效液相色譜(HPLC)相結(jié)合，定性定量分析鹽水鴨中生物胺的組成及含量，從而為預防和控制生物胺的形成和累積提供重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽水鴨樣品于2010年8月購自南京某鹽水鴨專賣店。隨機取2只，托盤包裝后于冰盒中攜至實驗室(2h內(nèi))，置4℃冰箱16h后取腿、腹、背、翅及頸肉，剪碎混合作為樣品。

色胺(Try)、2-苯乙胺(Phe)、腐胺(Put)、尸胺(Cad)、組胺(His)、酪胺(Tyr)、亞精胺(Spd)、精胺(Spm)標準品 美國Sigma公司；衍生劑丹酰氯 日本TCI公司；乙腈、丙酮(色譜純)；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2695型高效液相色譜系統(tǒng) 美國Waters公司； Utleaturrax T25勻漿器 德國IKA公司；臺式高速冷凍離心機 德國Herolab公司；JS-680C全自動凝膠成像分析儀上海培清科技有限公司。

1.3 TLC法實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制[5]

用50g/L三氯乙酸(TCA)配成5.0mg/mL的各生物胺標準儲備液；用儲備液配制各單標的質(zhì)量濃度為50μg/mL，混合標準溶液質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20μg/mL。

1.3.2 樣品處理[6]

取10g樣品，加入20mL 50g/L的TCA，勻漿，18℃，3000r/min離心10min，沉淀用2×10mL 50g/L TCA洗滌，收集3次上清液，定容到50mL，0.22μm有機膜過濾，避光冷藏。

1.3.3 衍生[7]

取5mL濾液和1mL標液，用3×2mL乙醚洗滌，棄去醚相，沸水浴蒸干水相；加1mL飽和NaHCO3溶液和丹酰氯(5mg/mL溶劑為丙酮)，塞緊混勻，40℃水浴避光反應(yīng)1h，加0.5mL 0.1g/mL甘氨酸(除去殘留丹酰氯)混合，塞子打開(揮發(fā)丙酮)，40℃避光反應(yīng)20min；加3mL水，用3×2mL乙醚洗滌，收集3次醚相；待乙醚揮發(fā)完畢，加入1mL乙酸乙酯，置冰箱保存待檢。

1.3.4 展開及顯色

展開劑組分為氯仿、乙醚、三乙胺，體積比依次為4∶1∶1、8∶1∶2和4∶0∶1；展開前加入25mL預飽和30min，通過分離效果確定最佳配比[5]。

點樣臺點樣，樣量2μL，間隔1.5cm，待樣點干燥后，置入展開槽內(nèi)，待展開劑擴展到距樣點17cm處取出，通風廚內(nèi)干燥，自動凝膠成像分析系統(tǒng)紫外燈下顯色，拍照。

1.4 HPLC法實驗方法

1.4.1 標準溶液的配制

準確稱取色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺各50mg，用0.4mol/L的高氯酸(HClO4)定容到50mL，配成1mg/mL儲備液備用。分別取以上標準品儲備液，用0.4mol/L HClO4配制成質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0、25.0、50、100μg/mL的混合標準溶液，鋁箔避光、4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 樣品處理

取10g待測樣品加入20mL 0.4mol/L HClO4勻漿，冷凍離心機4℃，2500r/min離心10min，沉淀部分如上述方法再提取一次，收集兩次上清液用0.4mol/L HClO4定容到50mL，0.22μm有機膜過濾，避光冷藏[8]。

1.4.3 標準溶液及樣品的衍生化

分別取上述1mL標準及樣品溶液，加入200μL 2mol/L NaOH溶液使之呈堿性，然后加入300μL的飽和NaHCO3溶液進行緩沖，再加入2mL丹酰氯溶液(10mg/mL丙酮為溶劑)，混勻，置于40℃水浴避光反應(yīng)30min，結(jié)束后加入100μL的氨水中止反應(yīng)，去除殘留的丹酰氯，最后用乙腈定容到5mL。檢測前用0.22μm的有機濾膜過濾。

1.4.4 色譜分析

采用液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為C18柱，紫外檢測波長為254nm，流速為1mL/min，流動相A為水，B為乙腈，采用梯度洗脫程序，進樣量20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 TLC法對鹽水鴨中生物胺的分析檢測結(jié)果

為了獲得較好的分離效果，本實驗選取4∶1∶1、8∶1∶2和4∶0∶1三個不同體積比的展開劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當氯仿、乙醚、三乙胺配比為4∶1∶1時，各生物胺拖尾較嚴重，分離效果不好；而當配比為4∶0∶1時，展開劑極性太強，各生物胺分布比較集中，分離效果同樣不佳；當配比為8∶1∶2時，解決了上述問題，分離效果較好。

圖1 不同質(zhì)量濃度的生物胺混合標樣的TLC檢測結(jié)果Fig.1 TLC patterns of mixed biogenic amine standards at different concentrations

圖1是8種生物胺標樣6個質(zhì)量濃度梯度的TLC分析結(jié)果，點樣量為2μL。當混標中各生物胺的質(zhì)量濃度為0.5μg/mL時，腐胺斑點亮度最強，但亮度隨著質(zhì)量濃度增加變化不明顯；尸胺及亞精胺有微弱斑點，其他生物胺未檢出。質(zhì)量濃度為1μg/mL時，除檢出前三種生物胺外，還檢出精胺，并且亮度隨著質(zhì)量濃度增加而增加，其他生物胺未檢出。質(zhì)量濃度為2μg/mL時，共6種生物胺被檢出，除前4種生物胺外新檢出組胺及酪胺；質(zhì)量濃度為5μg/mL時，共7種生物胺檢出，新檢出苯乙胺；質(zhì)量濃度為20μg/mL時，色胺被檢出，此時8種生物胺全部被檢出。由上分析得出8種生物胺檢出次序為腐胺、尸胺及亞精胺、精胺、組胺及酪胺、苯乙胺和色胺；表明TLC對腐胺的檢測限值最低，尸胺及亞精胺次之，色胺最高；可見TLC對生物胺的檢出限會因胺物質(zhì)的種類不同而有所差異，這與Shalaby等[7]的研究結(jié)果基本一致。

圖2 標樣及樣品中生物胺的TLC分析結(jié)果Fig.2 TLC patterns of single biogenic standards (50μg/mL) and samples

圖2是標樣及樣品中生物胺的檢測結(jié)果，其中泳道1到6分別是各個生物胺標準樣品，而泳道7和8對應(yīng)兩個樣品。在該分離條件下，6種標樣獲得了相對較好的分離效果；同時，發(fā)現(xiàn)在酪胺對應(yīng)的泳道上有兩個點，這與Costantini等[9]的實驗結(jié)果一致。樣品中由于酪胺的含量較低，其低點未能檢測出；由圖2可見，從兩個鹽水鴨樣品中分別都檢測到6種生物胺，按分離次序，從下到上依次為腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、酪胺和2-苯乙胺；但在水平方向上與樣品中斑點存在微小差異，這可能與樣品中雜質(zhì)較多，分子間發(fā)生作用有關(guān)。樣品1中腐胺對應(yīng)的斑點較樣品2的亮度大，表明樣品1中腐胺含量多于樣品2，這與HPLC的檢測結(jié)果一致，HPLC檢測到樣品1中腐胺含量為11.85μg/g，而樣品2中未檢出；這表明TLC法對腐胺檢測限值較低，與上述結(jié)果吻合；同理，對于尸胺的分析，樣品1較樣品2中斑點亮度大，而HPLC對兩樣品的檢測值分別為55.20μg/g和14.90μg/g，兩種方法結(jié)果吻合；而亞精胺、精胺、酪胺及2-苯乙胺由于含量差別不大，斑點亮度幾乎一致；這表明TLC分析結(jié)果可靠度較高，可在樣品進行HPLC分析之前，先用TLC進行定性分析。

2.2 HPLC法對鹽水鴨中生物胺的分析檢測結(jié)果

圖3 生物胺混標的標準色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed biogenic amine standards

如圖3所示，在實驗選取的色譜條件下，各生物胺能有效分離，且峰形對稱，沒有拖尾等現(xiàn)象，因此可以采用此條件對樣品中的生物胺進行分析。圖4、5是樣品1和樣品2中生物胺的檢測結(jié)果，表1所示的是樣品中各生物胺的含量。各生物胺的含量均在204μg/g以下，從樣品1中依次檢測出2-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、精胺及亞精胺共6種生物胺；其中亞精胺的含量最大，達203.72μg/g，腐胺的含量最小為11.15μg/g；從樣品2中依次檢測出2-苯乙胺、尸胺、酪胺、精胺及亞精胺等共5種生物胺，其中亞精胺的含量最大達200.67μg/g，酪胺的含量最小為11.27μg/g，腐胺未檢出。

圖4 樣品1的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of sample 1

圖5 樣品2的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of sample 2

表1 樣品中各生物胺的含量Table 1 Contents of biogenic amines in samples 1 and 2

3 討 論

利用TLC與HPLC法均從鹽水鴨樣品中檢測到了酪胺、腐胺、精胺、尸胺、2-苯乙胺及亞精胺共6種生物胺，并且研究發(fā)現(xiàn)TLC對各種生物胺的檢測限值較低，故TLC可以作為一種便捷、經(jīng)濟的定性分析食品中生物胺的方法。

托盤包裝鹽水鴨在4℃冰箱貯藏16h后，由于加工及貯藏過程中污染的微生物的生長，使得產(chǎn)品中生成了多種生物胺。由于污染的微生物種類和數(shù)量不同，鹽水鴨樣品中存在的生物胺種類及含量可能存在差異。兩個樣品均未檢出色胺與組胺，表明該樣品在加工和貯藏過程中，未污染具有色氨酸和組氨酸這兩種脫羧酶活性的微生物。前人研究發(fā)現(xiàn)不同菌株在產(chǎn)生生物胺的種類及含量上存在著較大差異，等[10]研究發(fā)現(xiàn)腸桿菌科主要產(chǎn)腐胺、尸胺、酪胺和組胺，其中弗氏檸檬酸桿菌屬產(chǎn)酪胺能力最強，此外乳桿菌中的一些菌株也呈酪胺陽性；Rivas等[11]研究了從高壓處理過的西班牙香腸chorizo中分離出來的200株乳酸菌和葡萄球菌在冷藏過程中的生物胺產(chǎn)生情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的最主要的生物胺為2-苯乙胺，其次為酪胺。在乳酸菌中，酪胺的產(chǎn)生主要與彎曲乳桿菌有關(guān)，而多數(shù)彎曲乳桿菌也是產(chǎn)生2-苯乙胺的陽性菌株；而在葡萄球菌中，肉糖葡萄球菌產(chǎn)2-苯乙胺或同時產(chǎn)2-苯乙胺和酪胺；陰溝腸桿菌和沙門氏亞種產(chǎn)腐胺和尸胺能力較強[12]。 Komprda等[13]在研究發(fā)酵劑對香腸中生物胺含量的影響中發(fā)現(xiàn)，精胺源于原料肉，且含量不會受到菌種的影響，因此推斷鹽水鴨樣品中較高濃度的亞精胺及精胺可能來源于鴨肉本身。

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[2]劉漢文, 顏秀花, 楊文平. 鹽水鴨生產(chǎn)工藝的研究[J]. 食品科技, 2008 (8)∶ 81-83.

[3]LI Yanliang, YAO Dongrui, WANG Daoying, et al. Sensory, physicochemical and microbiological changes in water-cooked salted duck during storage at 4 ℃[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Science, 2010, 23(7)∶ 960-964.

[4]盧士玲, 徐幸蓮, 周光宏, 等. 傳統(tǒng)中式香腸中生物胺調(diào)查研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2009, 35(10)∶ 141-146.

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Biogenic Amines in Salted Duck Analyzed by TLC Combined with HPLC

WANG Feng-qin1，LIU Fang1，MENG Yong2，WANG Dao-ying1，ZHU Yong-zhi1，XU Wei-min1,*
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China；2. Quality Supervision and Testing Center for Fishery Products (Nanjing), Ministry of Agriculture, Nanjing 210017, China)

The composition and contents of biogenic amines in salted duck were analyzed by thin layer chromatography (TLC) combined with high performance liquid chromatography (HPLC). Six biogenic amines including putrescine, cadaverine, spermidine, spermine, tyramine and 2-phenylethylamine were detected in salted duck samples by TLC. Similarly, six biogenic amines were also detected by HPLC, and the concentration of each biogenic amine was less than 204μg/g. The analytical results obtained by both methods were consistent. Therefore, TLC can be used as an economic and rapid method for the qualitative analysis of biogenic amines in meat products.

salted duck；biogenic amines；thin layer chromatography (TLC)；high performance liquid chromatography (HPLC)

TS251.68

A

1002-6630(2011)14-0273-04

2010-10-25

江蘇省自然科學基金項目(BK2010469)；江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新基金項目(CX(10)440)

王鳳芹(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為食品質(zhì)量安全。E-mail：lfklds@yahoo.com.cn

*通信作者：徐為民(1969—)，男，研究員，博士，研究方向為食品加工與質(zhì)量控制。E-mail：weiminxu2002@yahoo.com.cn