商 穎，許文濤,，元延芳，梁志宏，石 慧，翟志芳，張雅楠，羅云波,，黃昆侖,,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，北京 100083)

通用引物多重PCR技術(shù)檢測(cè)3種病原微生物

商 穎1，許文濤1,2，元延芳2，梁志宏2，石 慧1，翟志芳1，張雅楠2，羅云波1,2，黃昆侖1,2,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(北京)，北京 100083)

為尋找快速且準(zhǔn)確的病原微生物檢測(cè)方法，在普通多重PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)的基礎(chǔ)上研究一種新的通用引物多重PCR(universal primers-multiplex PCR，UP-M-PCR)技術(shù)。利用該技術(shù)對(duì)食品中主要的3種致病菌——大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門(mén)氏菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，經(jīng)過(guò)單重PCR驗(yàn)證、二重以及三重UP-PCR反應(yīng)條件和體系優(yōu)化。結(jié)果表明，該方法的最低檢測(cè)限為0.5pg目標(biāo)DNA，復(fù)合引物和通用引物的加入量分別為2nmol/L和300nmol/L。此方法檢測(cè)靈敏度高、病原菌檢測(cè)限低，可在實(shí)踐中應(yīng)用。

大腸桿菌；單增李斯特菌；沙門(mén)氏菌；通用引物；多重PCR

食品是人類(lèi)賴(lài)以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，食品安全關(guān)系到人體健康和國(guó)計(jì)民生，食源性致病菌檢驗(yàn)更是食品安全檢驗(yàn)的重中之重。近些年來(lái)，世界范圍內(nèi)大規(guī)模的生物性污染引起的食源性疾病爆發(fā)事件屢屢發(fā)生，如日本的出血性大腸埃希菌O157:H7污染、法國(guó)的李斯特菌中毒、美國(guó)的沙門(mén)氏菌屬污染等，食品安全已成為世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題，而以上3種菌也是存在于食物中并且導(dǎo)致食源性疾病的最主要病原菌[1]。

目前對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)仍主要依靠傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、血清學(xué)、生化鑒定等方法，這些方法不但檢測(cè)周期長(zhǎng)，而且操作繁瑣復(fù)雜，特異性、靈敏度均較低，無(wú)法對(duì)人工難以培養(yǎng)的病原細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)[2-3]，以上缺點(diǎn)都限制了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的應(yīng)用。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單，而被廣泛應(yīng)用于食品病原細(xì)菌的檢測(cè)中。由于單一PCR檢測(cè)成本高，食品樣品中往往存在的病原細(xì)菌種類(lèi)很多，有可能涉及不同種和型別的細(xì)菌，人們進(jìn)而開(kāi)發(fā)了多重PCR技術(shù)[4-6]。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來(lái)的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù)，是在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多條目的DNA片段的方法[7-8]。但是，通常情況下由于引物的性質(zhì)差異，每個(gè)特異性引物的擴(kuò)增效率不同，擴(kuò)增產(chǎn)物比例不一致，使得有些目的基因得不到清晰的擴(kuò)增條帶，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性[9]。

本研究在普通多重PCR的基礎(chǔ)上，建立起一種通用引物——多重PCR技術(shù)(universal primer-multiplex PCR，PU-M-PCR)，此技術(shù)可以克服普通多重PCR擴(kuò)增效率不一致等的缺點(diǎn)，提高檢測(cè)靈敏度，降低檢測(cè)成本和檢測(cè)限，從而為簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)病原微生物提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 菌株以及培養(yǎng)

沙門(mén)氏菌Salmonella spp.(strains CGMCC 1.0090和CGMCC 1.1552) 中國(guó)科學(xué)院微生物所；單增李斯特菌L. monocytogenes(strains CMCC 55004和CMCC 55007) 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；非致病性大腸桿菌E. coli (BL21)和E. coli (JM109) 本實(shí)驗(yàn)室分離；E. coli O157:H7 EDL933中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病微生物學(xué)研究所景懷奇研究員饋贈(zèng)。

菌株凍干粉的活化條件：LB培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母浸粉、10g/L NaCl和15g/L瓊脂)或胰酶解大豆酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(胰酶解大豆酪蛋白肉湯、18g/L瓊脂)、37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

活化后細(xì)菌的培養(yǎng)條件：選取單菌落于50mL LB液體培養(yǎng)基或500mL胰酶解大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基，200r/min搖床培養(yǎng)20～22h。

1.2 基因組DNA提取

表1 引物序列Table1 Primer sequences used in this study

純菌培養(yǎng)物基因組提?。?mL菌懸液(OD＞1.8) 8000r/min離心5min，1.5mL PBS緩沖液洗滌沉淀并且重懸，反復(fù)兩次。采用優(yōu)化的CTAB法提取細(xì)菌基因組DNA[10-11]。

將基因組DNA溶于300μL TE緩沖液；采用Wizard DNA Purification Kit(美國(guó)普洛麥格公司)對(duì)DNA進(jìn)行純化；純化后，用 Pico Green試劑對(duì)DNA進(jìn)行熒光定量。特異性和靈敏性測(cè)試時(shí)，用雙蒸水稀釋目的基因組。

1.3 引物序列

大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門(mén)氏菌的特異引物分別為Ecoli 670-F/R、LM404-F/R、Sal284-R/F[12-14]。UPM-PCR體系中，用于檢測(cè)大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門(mén)氏菌的復(fù)合引物在以上3種特異性引物5′端接上一段新序列——CCTTCCTTCCTTCCCCCC，此序列即為本研究新PCR體系中的通用引物UP。各引物序列如表1所示。

1.4 復(fù)合引物單重PCR特異性驗(yàn)證

復(fù)合引物是在普通特異性引物的5′端接上一段序列，其特異性與普通引物特異性是否一致，以及擴(kuò)增產(chǎn)物片度大小是否相同有待于對(duì)比。在此部分的研究中同時(shí)進(jìn)行兩組對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其中反應(yīng)體系中，一組的引物為普通引物，另一組為復(fù)合引物，其余試劑均相同。熱循環(huán)程序?yàn)椋?4℃變性5min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、50s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%(質(zhì)量濃度)的瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.5 通用引物多重PCR(UP-M-PCR)反應(yīng)原理及反應(yīng)條件

與普通多重PCR體系相比，UP-M-PCR體系中除了含有3對(duì)目的基因復(fù)合特異性引物之外，還含有一對(duì)通用引物UP。在PCR反應(yīng)的前10個(gè)循環(huán)，復(fù)合引物主要發(fā)揮作用，進(jìn)行擴(kuò)增，而通用引物UP由于沒(méi)有目標(biāo)模板，無(wú)法進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)特異性引物用盡，擴(kuò)增產(chǎn)物得到一定程度的積累，通用引物開(kāi)始以得到的產(chǎn)物為模板，進(jìn)行序列擴(kuò)增。本研究對(duì)此方法的可行性進(jìn)行驗(yàn)證。

UP-M-PCR體系中，復(fù)合引物的特異性根據(jù)溫度溶解曲線(xiàn)-SYBR GREENⅠPCR方法測(cè)試[11]，并且采用單重、二重、三重PCR對(duì)3種引物的比例進(jìn)行優(yōu)化。由于PCR反應(yīng)中，鎂離子的濃度是影響擴(kuò)增特異性的一個(gè)重要因素[15-17]，因此，在UP-M-PCR體系中MgCl2含量為1.8mmol/L，比單重PCR含量稍高。優(yōu)化后的體系為1.8mmol/L MgCl2、200μmmol/L dNTPs和1.5U DNA聚合酶、300nmol/L通用引物、2nmol/L每個(gè)復(fù)合引物。模板加入量從500、50、5、0.5、0.05pg依次進(jìn)行測(cè)試，反應(yīng)總體系為30μL，剩余體積用雙蒸水補(bǔ)齊。

采用梯度PCR進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，退火溫度范圍為56～64℃。最終熱循環(huán)程序?yàn)椋?4℃變性5min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、50s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

普通多重PCR中不含通用引物，除了特異引物的含量為300nmol/L，其他試劑量與UP-M-PCR體系相同。熱循環(huán)程序?yàn)椋?4℃變性5min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、50s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合引物特異性驗(yàn)證

由于復(fù)合引物是在普通引物的5′端加了一段通用引物序列，因此通用引物擴(kuò)增得到的產(chǎn)物片段較普通引物擴(kuò)增的產(chǎn)物片段大36bp，所以2、3、4泳道的條帶較5、6、7泳道的條帶位置略低。此部分研究的結(jié)果如圖1所示，每一對(duì)引物都得到相應(yīng)特異性的擴(kuò)增條帶，且目的條帶的亮度相似。說(shuō)明復(fù)合引物與普通引物對(duì)目的片段的特異性一致。

圖1 復(fù)合引物特異性驗(yàn)證Fig.1 Verification of the specificity of composite specific primers

2.2 通用引物單重PCR可行性驗(yàn)證

此部分的研究中，一組單重PCR反應(yīng)體系中只加入復(fù)合引物，另一組反應(yīng)體系除了加入復(fù)合引物外，還加入了通用引物，結(jié)果如圖2、3所示。由圖可知，當(dāng)復(fù)合引物加入量降低到2nmol/L時(shí)，已經(jīng)得不到擴(kuò)增條帶。而當(dāng)復(fù)合引物量為2nmol/L，同時(shí)加入300nmol/L通用引物，得到的條帶依然非常清晰，與圖2第2泳道得到的擴(kuò)增產(chǎn)物量相當(dāng)。因此，為了優(yōu)化UP-M-PCR反應(yīng)體系，復(fù)合引物和通用引物的加入量即可分別定為2nmol/L和300nmol/L。

圖2 復(fù)合引物單重PCR結(jié)果Fig.2 Composite specific primers in single PCR

圖3 通用引物單重PCR可行性驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Feasibility of universal primers in single PCR

2.3 通用引物多重PCR可行性驗(yàn)證

圖4 通用引物二重PCR可行性驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Feasibility of universal primers in duplex PCR

在反應(yīng)體系中逐漸減少?gòu)?fù)合引物的加入量，以?xún)?yōu)化反應(yīng)條件。結(jié)果如圖4所示，其中706bp和440bp為大腸桿菌O157和單增李斯特菌的特異性條帶。由圖可知，當(dāng)兩對(duì)復(fù)合引物的加入量都在2nmol/L時(shí)，已得不到目的條帶；相反，當(dāng)復(fù)合引物的加入量為2nmol/L，同時(shí)加入300nmol/L通用引物，依然可以得到非常清晰的目的條帶。此結(jié)果與2.2節(jié)得到的結(jié)果一致。

2.4 UP-M-PCR特異性和靈敏度

為研究同時(shí)加入3對(duì)復(fù)合引物是否會(huì)產(chǎn)生非特異條帶，進(jìn)行4組多重UP-PCR。每組PCR反應(yīng)體系包括3對(duì)復(fù)合引物各2nmol/L、通用引物300nmol/L、模板為3種致病菌基因組DNA的混合物。結(jié)果如圖5所示，其中706、440bp和320bp分別為大腸桿菌O157、單增李斯特菌和沙門(mén)氏菌的特異性條帶，每對(duì)引物的特異性很高，在整個(gè)體系中引物對(duì)之間同時(shí)存在，沒(méi)有出現(xiàn)非特異性條帶。

圖5 UP-M-PCR特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Specificity of the developed UP-M-PCR method

圖6 UP-M-PCR靈敏度驗(yàn)證Fig.6 Sensitivity of the developed UP-M-PCR method

靈敏度測(cè)試結(jié)果如圖6所示，擴(kuò)增效率隨模板量減少而降低，同時(shí)條帶的清晰度也隨之下降，當(dāng)模板量減少至0.05pg時(shí)，已得不到目的條帶。所以，UP-MPCR的檢測(cè)限為0.5pg目標(biāo)DNA。

3 討 論

通用引物三重PCR體系中，反應(yīng)的前10個(gè)循環(huán)，復(fù)合特異性引物主要發(fā)揮作用，進(jìn)行擴(kuò)增，而通用引物UP由于沒(méi)有目標(biāo)模板，無(wú)法進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)特異性引物用盡，擴(kuò)增產(chǎn)物得到一定程度的積累，通用引物開(kāi)始以得到的產(chǎn)物為模板，進(jìn)行序列擴(kuò)增，最終產(chǎn)生3個(gè)不同長(zhǎng)度的目的片段。體系中，復(fù)合引物的加入量從200nmol/L減少到2nmol/L時(shí)，若不加通用引物，隨著引物量的減少，擴(kuò)增條帶的清晰度依次降低，直至最后擴(kuò)增不到擴(kuò)增條帶。雖然復(fù)合引物的加入量?jī)H為2nmol/L，但通過(guò)加入通用引物UP，依然可以得到非常清楚的擴(kuò)增條帶。因此，復(fù)合引物的最佳反應(yīng)濃度為2nmol/L，約為普通多重PCR反應(yīng)體系中濃度的1%，而通用引物的濃度為正常濃度300nmol/L。因此，UP-MPCR體系中，總的引物含量較普通三重PCR體系更少，僅為其1/4，不僅可以節(jié)約復(fù)合引物消耗，而且通過(guò)通用引物消除不用復(fù)合引物之間的擴(kuò)增性質(zhì)差異。

在對(duì)微生物的檢測(cè)中，提高靈敏度和降低檢測(cè)限一直是學(xué)者們關(guān)系的問(wèn)題，在本研究中，通過(guò)對(duì)模板加入量的研究得到：當(dāng)混合模板中，其中有一種目標(biāo)DNA減少到0.5pg時(shí)，依然可以擴(kuò)增到清晰的條帶，而且無(wú)非特異性條帶出現(xiàn)。此方法技術(shù)降低了檢測(cè)限，提高了檢測(cè)的靈敏度，為簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)病原微生物提供和開(kāi)辟了一種新方法和手段。對(duì)保障食品安全與國(guó)民健康具有重要意義。

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Employing Universal Primers-Multiple PCR to Detect Three Pathogenic Microorganisms

SHANG Ying1，XU Wen-tao1,2，YUAN Yan-fang2，LIANG Zhi-hong2，SHI Hui1，ZHAI Zhi-fang1，ZHANG Ya-nan2，LUO Yun-bo1,2，HUANG Kun-lun1,2,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；2. Supervision, Inspection & Testing Center of Genetically Modified Food Safety, Ministry of Agriculture, Beijing 100083, China)

A fast, accurate and novel universal primers-multiplex PCR (UP-M-PCR) method was developed to detect three common pathogenic microorganisms in food matrices simultaneously: Escherichia coli, Listeria monocytogenes and Salmonella spp. The specificity of the constructed complex primers was verified by single-PCR, and the duplex and triplex-PCR reaction systems and conditions were optimized. The developed method had a limit of detection of 0.5 pg target DNA. The additions of the complex specific primers and universal primers were 2 nmol/L and 300 nmol/L, respectively. The new UP-M-PCR method has the advantages of high sensitivity and low detection limit and can thus be applied in practice.

Escherichia coli；Listeria monocytogenes；Salmonella spp.；universal primer；multiplex PCR (polymerase chain reaction)

Q789；R446.5

A

1002-6630(2011)10-0103-04

2010-06-22

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z440)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30800770)；科技部轉(zhuǎn)基因生物重大專(zhuān)項(xiàng)(2008ZX08012-001)

商穎(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：cauxwt@yahoo.cn

*通信作者：黃昆侖(1968—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：hkl009@163.com