黃 一,吳秋平,陳小波綜述,閔家新審校

（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院胸外科,重慶400037）

細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡,是多細(xì)胞生物維持生長發(fā)育和組織形態(tài)所特有的,由多種基因參與表達(dá)、精密調(diào)控的細(xì)胞主動死亡過程。NIX是近年來發(fā)現(xiàn)的隸屬于Bcl-2家族中的BH3-only促凋亡家族成員。雖然具有Bcl-2家族特征性的BH3域和羧基末端跨膜結(jié)構(gòu)域（TM）,也能與Bcl-2形成二聚體,但NIX的促凋亡活動明顯不同于其他Bcl-2家族成員,本文通過對NIX的促凋亡功能機(jī)制以及其在細(xì)胞自噬、線粒體自噬、腫瘤及心肌疾病發(fā)病機(jī)制等方面的研究進(jìn)展作一綜述。

1 NIX的發(fā)現(xiàn)和特征描述

NIX又稱Bcl-2/E1B 19kDa-interacting protein 3-like,是基于與BNIP3存在56%的同源性,由人胎盤cDNA文庫中克隆而來。與BINP3類似,NIX編碼產(chǎn)物含有Bcl-2的BH3和TM結(jié)構(gòu)域,屬于BH3-only促凋亡家族成員,能與Bcl-2、Bcl-X1、E1B19K等蛋白相互作用,促使細(xì)胞色素C的釋放,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明,NIX定位于線粒體,并可以在短暫表達(dá)的同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,Bcl-2和Bcl-XL在NIX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起保護(hù)作用,NIX對蛋白酶依賴性降解非常敏感。因此，NIX和BNIP3享有幾個(gè)共同的主要特征,包括與Bcl-2和Bcl-XL的相互作用,通過羧基端跨膜區(qū)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,具有與BNIP3類似的促凋亡能力。

2 由缺氧誘導(dǎo)的促凋亡蛋白

正常組織中不能檢測到NIX基因或蛋白。在多種細(xì)胞系的體外培養(yǎng)缺氧誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),NIX啟動子含有功能性缺氧反應(yīng)元件（HRE）,是缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的直接靶基因,在缺氧條件下細(xì)胞內(nèi)NIX mRNA水平及NIX蛋白水平升高,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程[1-3]。

早期研究發(fā)現(xiàn),在缺氧條件下,除了一些共知的缺氧調(diào)節(jié)基因有表達(dá)變化之外,NIX mRNA表達(dá)水平也有較明顯的升高現(xiàn)象。在缺氧條件下,NIX mRNA表達(dá)水平迅速升高,達(dá)正常條件時(shí)5倍之多。NIX的表達(dá)不但由HIF-1α誘導(dǎo),也由轉(zhuǎn)錄因子早期生長反應(yīng)因子（EGR2）和p53誘導(dǎo)表達(dá)[4-5]。EGR2是一種肺創(chuàng)傷后高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[6]。p53不但與腫瘤抑制相關(guān),現(xiàn)更多的研究集中在其作為轉(zhuǎn)錄因子方面。這些研究表明,NIX在缺氧介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的病理進(jìn)展中有著特殊作用。

3 NIX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制

NIX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制目前尚不清楚。多項(xiàng)研究表明,NIX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并不是通過單一機(jī)制,而是根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)條件的不同,存在多條通路。關(guān)于NIX的促凋亡活動,也與BNIP3非常相似,盡管它屬于Bcl-2家族,也能與Bcl-2形成二聚體,但是它促凋亡的活性明顯不同于Bcl-2家族的其它成員。目前認(rèn)為NIX與線粒體膜結(jié)合后引起線粒膜通透性孔開放,線粒體內(nèi)膜跨膜電位（△Ψm）降低,活性氧增加,引起細(xì)胞死亡。NIX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡不依賴于Caspases、細(xì)胞色素C的釋放,而與它跨膜結(jié)構(gòu)域 TM有關(guān)。NIX引起的細(xì)胞死亡發(fā)生時(shí)間較典型性凋亡晚,一般在缺氧72h后發(fā)生,它引起漿膜和線粒體的損傷,引起染色體DNA斷裂成大分子片段,呈現(xiàn)非典型性凋亡的特點(diǎn)[7-8]。

NIX屬于典型的BH3-only蛋白,但多項(xiàng)研究表明NIX并非通過依賴細(xì)胞色素C和Caspases的釋放,最終激活DNA斷裂因子40（DNA fragmentation factor 40,DEF40）引起染色體DNA斷裂成小分子片段這一典型的細(xì)胞凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡：（1）與典型的BH3-only蛋白比較,NIX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力較弱[9]；（2）典型的BH3-only蛋白通過細(xì)胞色素C的釋放,不依賴于1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）而引起細(xì)胞死亡,而NIX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中含有MPTP的開放；（3）典型BH3-only蛋白的促凋亡活動高度依賴于BH3結(jié)構(gòu)域,而NIX的促凋亡活動主要由TM所決定；（4）與典型的BH3-only蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相比,NIX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在形態(tài)學(xué)上有著明顯的不同。并不排除典型細(xì)胞凋亡機(jī)制參與NIX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能性,然而,它卻難以解釋依賴于MPTP這一主要途徑的存在。

最近的一項(xiàng)研究為NIX誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的第3種潛在機(jī)制提供了證據(jù)[10]。Bax/Bak、Bcl-2對于細(xì)胞凋亡有相反作用的影響,至少部分影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌質(zhì)網(wǎng)（ER/SR）的鈣池、線粒體的鈣攝取和M PTP[11-12]。在這項(xiàng)研究中,NIX的過表達(dá)及抑制分別表現(xiàn)為心肌細(xì)胞ER/SR鈣池水平的升高和降低。通過遺傳消融去除對ER/SR鈣吸收泵的抑制,恢復(fù)鈣池水平,可以逆轉(zhuǎn)因NIX缺乏而對由Gaq介導(dǎo)的心肌疾病造成的有利影響。此外,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的NIX可導(dǎo)致線粒體膜的去極化和細(xì)胞凋亡。這個(gè)機(jī)制是否與非心肌細(xì)胞有關(guān)尚待研究。

4 細(xì)胞自噬

NIX除了參與細(xì)胞凋亡以外,另一個(gè)有趣的方面是NIX的蛋白質(zhì)生物學(xué)特性在細(xì)胞自噬中的作用。細(xì)胞自噬最初被認(rèn)為是基于細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特性,特別是包繞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的雙模結(jié)構(gòu),被稱為自噬體。細(xì)胞自噬是有機(jī)體內(nèi)原始的分解代謝程序,是機(jī)體一種重要的防御和保護(hù)機(jī)制。細(xì)胞可以通過自噬和溶酶體,消除、降解、消化受損和變性,以及衰、老失去功能的細(xì)胞、細(xì)胞器和變性蛋白質(zhì)與核酸等生物大分子,為細(xì)胞的重建、再生和修復(fù)提供必需原料,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的再循環(huán)和再利用[13]。

Daido等[14]在研究由神經(jīng)酰胺介導(dǎo)的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬過程中,首次描述了BNIP3在細(xì)胞自噬中的作用。在這個(gè)過程中,神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)BNIP3表達(dá)增高,而BNIP3造成線粒體除極化和自噬。在另一個(gè)缺血再灌注模型中,BNIP3通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬而保護(hù)HL-1心肌細(xì)胞[15]。同樣,缺氧誘導(dǎo)的BNIP3表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞自噬,但卻可保護(hù)骨肉瘤細(xì)胞免于壞死[16]。另外,細(xì)胞自噬與肌萎縮的發(fā)病機(jī)制有關(guān),BNIP3和NIX在其中起著正調(diào)節(jié)的作用,他們在骨骼肌中的表達(dá)都可以誘導(dǎo)自噬體的形成[17]。

因此,BNIP3和NIX具有雙重特性,他們既誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,也參與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。由BNIP3和NIX誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬在某些情況下具有保護(hù)作用,然后他們又與自噬性細(xì)胞凋亡有關(guān)。關(guān)于后者,目前尚不清楚這種細(xì)胞凋亡是由于過度的細(xì)胞自噬造成,還是由BNIP3或NIX誘導(dǎo)的獨(dú)立的細(xì)胞凋亡形式。

5 NIX與心肌疾病

國外研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2家族成員在心肌疾病的病理生理過程中起著重要作用。不同于BNIP3在新生小鼠心肌細(xì)胞中由缺氧誘導(dǎo)引起細(xì)胞凋亡的過程[18],NIX是由與心肌肥大有關(guān)的細(xì)胞信號所調(diào)控的,即心肌細(xì)胞中的Gaq信號肽和蛋白激酶鈣通過結(jié)合在NIX啟動子上的SP1位點(diǎn),對NIX產(chǎn)生調(diào)控作用。通過近幾年的研究,NIX在心肌細(xì)胞凋亡方面的作用已經(jīng)在體內(nèi)得到證實(shí),NIX在心肌細(xì)胞中的高度表達(dá)可導(dǎo)致致命的新生兒圍生期心肌病。然而,對于被去掉羧基端,存在線粒體定位缺陷的NIX,卻可以對Gaq高表達(dá)的新生兒產(chǎn)生相反的保護(hù)作用[2]。并且,通過對小鼠的研究發(fā)現(xiàn),NIX缺失可保護(hù)由Gaq介導(dǎo)的壓力負(fù)荷型心臟病[1]。因此在心肌疾病中，BNIP3和NIX介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路是由心肌缺血、缺氧以及心肌肥大所調(diào)節(jié)的。

6 NIX與腫瘤

NIX與缺氧介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。在對缺氧條件下的中國倉鼠卵巢K1細(xì)胞的減除雜交法（subtractive hybridization）實(shí)驗(yàn)證明,缺氧可誘導(dǎo)NIX mRNA高表達(dá)。此外,NIX蛋白也被缺氧誘導(dǎo),并與細(xì)胞凋亡有關(guān)。NIX啟動子中含有兩個(gè)HIF-1α結(jié)合位點(diǎn),其中涉及編譯啟動密碼子的-234位點(diǎn)是缺氧和HIF-1α反式激活所必需的。缺氧對于腫瘤是負(fù)面的預(yù)后指標(biāo),因而NIX的異常表達(dá)與侵襲性疾病有關(guān)[19]。Fei等[4]通過對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞移植入動物體內(nèi)模型的研究發(fā)現(xiàn),NIX被沉默的腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下生長的速度比含有正常NIX的腫瘤細(xì)胞快,NIX在轉(zhuǎn)錄中和轉(zhuǎn)錄后期由缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和p53參與調(diào)節(jié),而且NIX是Bcl-2家族中缺氧條件下惟一表達(dá)升高的抑癌基因。p53是具有代表性的腫瘤抑制基因,在壓力條件下（如放射、化療以及組織缺氧）,p53能正常清除腫瘤,然而組織缺氧也能夠誘導(dǎo)p53發(fā)生突變,失去抗腫瘤的能力。NIX不像p53的其他調(diào)控基因（Puma、DRS、Bax或p21基因）,在缺氧條件下,仍然有被p53誘導(dǎo)激活的可能性。DNA損傷后,NIX表達(dá)受到p53的調(diào)控,p53通過其特異性的DNA結(jié)合片段,結(jié)合到NIX基因上,通過激活NIX的轉(zhuǎn)錄而直接調(diào)控NIX的表達(dá)。同時(shí)NIX在缺氧環(huán)境下反過來介導(dǎo)p53依賴的細(xì)胞凋亡進(jìn)程。在腫瘤移植的動物模型中,實(shí)驗(yàn)性下調(diào)NIX的表達(dá),可以加速腫瘤細(xì)胞生長。國外文獻(xiàn)報(bào)道在多種腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)HIF-1α誘導(dǎo)BNIP3、NIX表達(dá)上調(diào)。Sowter等[3]和Guo等[20]采用原位雜交方法,發(fā)現(xiàn)BNIP3、NIX在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào),且表達(dá)見于壞死區(qū)周邊區(qū)域。

這些研究結(jié)果表明,缺氧可通過BNIP3、NIX等因子對腫瘤細(xì)胞的凋亡敏感性進(jìn)行篩選,不表達(dá)或弱表達(dá)BNIP3、NIX的腫瘤細(xì)胞能夠耐受缺氧繼續(xù)生長；高表達(dá)BNIP3、NIX的腫瘤細(xì)胞則發(fā)生凋亡,繼而壞死。穩(wěn)定的NIX表達(dá)可以減緩腫瘤細(xì)胞的生長速度。在缺氧條件下,NIX在各種細(xì)胞和組織類型中都有高水平表達(dá),這表明NIX可能是在缺氧條件下存在的腫瘤抑制基因,NIX的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

7 NIX與線粒體自噬的發(fā)生機(jī)制

最初,最簡單的NIX依賴的線粒體自噬模型被認(rèn)為是NIX觸發(fā)線粒體的除極化,從而引起線粒體自噬和清除,這個(gè)模型已被大量的研究結(jié)果所證實(shí)[21]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)超過16h的網(wǎng)織紅細(xì)胞中,引起線粒體發(fā)生除極化的復(fù)合物,能夠逆轉(zhuǎn)因NIX缺失而引起的線粒體清除率降低[22]。但沒有證據(jù)能解釋,在網(wǎng)織紅細(xì)胞中,NIX直接觸發(fā)線粒體除極化這一過程。目前認(rèn)為依賴于NIX的線粒體除極化時(shí)間發(fā)生在自噬體的形成與消除之間[23]。通過對具有自噬缺陷的網(wǎng)織紅細(xì)胞中線粒體清除率的研究,可能會解決上述問題。

對于NIX觸發(fā)線粒體除極化這一推論,面臨的另一個(gè)問題在于它不依賴于Bax和Bak[24]。而值得注意的是,對于能夠逆轉(zhuǎn)NIX缺失的ABT-737是需要Bax或Bak來誘導(dǎo)線粒體除極化和細(xì)胞凋亡[22],這似乎與 NIX的機(jī)制不同。然而，NIX可能通過不依賴于Bax或Bak的其他通路導(dǎo)致線粒體除極化。盡管如此,這僅僅是推測,主要是因?yàn)榫€粒體清除的發(fā)生同樣不依賴于MPTP[24],這種不依賴于Bax、Bak和MPTP的現(xiàn)象也說明了依賴于NIX的線粒體自噬不同于其他任何由BNIP3或NIX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制。

第二種依賴于NIX的線粒體自噬模型假設(shè)NIX具有另一種獨(dú)立的、不依賴于觸發(fā)線粒體除極化的能力,稱為恢復(fù)自噬元件。正如之前討論過的,使BNIP3或NIX過度表達(dá)可在不同條件下誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[14-17,25],這說明誘導(dǎo)細(xì)胞自噬可能是這些蛋白的本質(zhì)特性。NIX缺失并非廣泛地削弱紅細(xì)胞的自噬能力,而是干擾針對線粒體的自噬體[22,24]。NIX可能作為線粒體自噬機(jī)制中的一個(gè)銜接蛋白和恢復(fù)元件而發(fā)揮作用,與這個(gè)推論相符,初步研究已證實(shí)NIX直接與微管相關(guān)蛋白LC3相互作用。

8 結(jié)論與展望

綜上所述,雖然NIX擁有Bcl-2家族中的BH3-only亞群的一些共同特征,諸如在BH3結(jié)構(gòu)域上的同源性,同樣定位于線粒體外膜,亦能與Bcl-2和Bcl-XL相互作用,但其引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制卻與典型的BH3-only蛋白完全不同。NIX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力較弱,通過引起線粒體內(nèi)膜跨膜電位（△Ψm）降低,線粒體膜通透性孔開放,活性氧增加,引起細(xì)胞死亡。并且,NIX的羧基末端跨膜結(jié)構(gòu)域并非BH3域,在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中扮演了重要的角色。隨后的研究證實(shí)了NIX誘導(dǎo)的非典型性細(xì)胞凋亡,而且同時(shí)它還誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬。目前仍不清楚NIX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的能力是兩個(gè)相互關(guān)聯(lián),還是各自獨(dú)立的功能。正如前文所述,NIX可能通過線粒體除極化導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,同時(shí)因此而引起細(xì)胞自噬；又或者兩者可能在發(fā)生機(jī)制上相互獨(dú)立,卻在功能上相互聯(lián)系。除腫瘤以及心肌細(xì)胞以外,缺氧條件下NIX高表達(dá)是否在其他組織（如急性肺損傷等）有同樣的誘導(dǎo)非典型細(xì)胞凋亡的能力,其促凋亡的具體機(jī)制及與在腫瘤、心肌基本方面的作用等一系列問題,還有待進(jìn)一步研究。

[1]Diwan A,Wansapura J,Syed FM,et al.Nix-mediated apoptosis links myocardial fibrosis,cardiac remodeling，and hypertrophy decompensation[J].Circulation,2008，117（3）：396-404.

[2]Yussman MG,Toyokawa T,Odley A,et al.Mitochondrial death protein Nix is induced in cardiac hypertrophy and triggers apoptotic cardiomyopathy[J].Nat Med,2002,8（7）：725-730.

[3]Sowter HM,Ratcliffe PJ,Watson P,et al.HIF-1-dependent regulation of hypoxic induction of the cell death factors BNIP3and NIX in human tumors[J].Cancer Res，2001,61（18）：6669-6673.

[4]Fei P,Wang W,Kim SH,et al.Bnip3L is induced by p53underhypoxia,and itsknockdown promotestumor growth[J].Cancer Cell,2004,6（6）：597-609.

[5]Unoki M,Nakamura Y.EGR2induces apoptosis in various cancer cell lines by direct transactivation of BNIP3L and BAK[J].Oncogene,2003,22（14）：2172-2185.

[6]Jin Y,Choi AM.Cytoprotection of heme oxygenase-1/carbon monoxide in lung injury[J].Proc Am Thorac Soc，2005,2（3）：232-235.

[7]Zhang J,Ney PA.Role of BNIP3and NIX in cell death，autophagy,and mitophagy[J].Cell Death Differ,2009,16（7）：939-946.

[8]Real PJ,Benito A,Cuevas J,et al.Blockade of epidermal growth factor receptors chemosensitizes breast cancer cells through up-regulation of Bnip3L[J].Cancer Res，2005,65（18）：8151-8157.

[9]Kim H,Rafiuddin-Shah M,Tu HC,et al.Hierarchical regulation of mitochondrion-dependent apoptosis by BCL-2subfamilies[J].Nat Cell Biol,2006,8（12）：1348-1358.

[10]Diwan A,Matkovich SJ,Yuan Q,et al.Endoplasmic reticulum-mitochondria crosstalk in NIX-mediated murine cell death[J].J Clin Invest,2009,119（1）：203-212.

[11]Nutt LK,Gogvadze V,Uthaisang W,et al.Indirect effects of Bax and Bak initiate the mitochondrial alterations that lead to cytochrome C release during arsenic trioxide-induced apoptosis[J].Cancer Biol Ther,2005,4（4）：459-467.

[12]Scorrano L,Oakes SA,Opferman JT,et al.BAX and BAK regulation of endoplasmic reticulum Ca2+：a control point for apoptosis[J].Science,2003,300（5616）：135-139.

[13]Yorimitsu T,Klionsky DJ.Autophagy：molecular machinery for self-eating[J].Cell Death Differ,2005,12Suppl 2： S1542-1552.

[14]Daido S,Kanzawa T,Yamamoto A,et al.Pivotal role of the cell death factor BNIP3in ceramide-induced autophagic cell death in malignant glioma cells[J].Cancer Res，2004,64（12）：4286-4293.

[15]Hamacher-Brady A,Brady NR,Logue SE,et al.Response to myocardial ischemia/reperfusion injury involves Bnip3and autophagy[J].Cell Death Differ,2007,14（1）：146-157.

[16]Tracy K,Dibling BC,Spike BT,et al.BNIP3is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy[J].Mol Cell Biol,2007,27（17）：6229-6242.

[17]M ammucari C,Milan G,Romanello V,et al.FoxO3controls autophagy in skeletal muscle in vivo[J].Cell Metab，2007,6（6）：458-471.

[18]Galvez AS,Brunskill E W,Marreez Y,et al.Distinct pathways regulate proapoptotic Nix and BNip3in cardiac stress[J].J Biol Chem,2006,281（3）：1442-1448.

[19]Burton TR,Gibson SB.The role of Bcl-2family member BNIP3in cell death and disease：NIPping at the heels of cell death[J].Cell Death Differ,2009,16（4）：515-523.

[20]Guo K,Searfoss G,Krolikowski D,et al.Hypoxia induces the expression of the pro-apoptotic gene BNIP3[J].Cell Death Differ,2001,8（4）：367-376.

[21]Twig G,Elorza A,Molina AJ,et al.Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy[J].EMBO J,2008,27（2）：433-446.

[22]Sandoval H,Thiagarajan P,Dasgupta SK,et al.Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells [J].Nature,2008,454（7201）：232-235.

[23]Zhang J,Ney PA.NIX induces mitochondrial autophagy in reticulocytes[J].Autophagy,2008,4（3）：354-356.

[24]Schweers RL,Zhang J,Randall MS,et al.NIX is required for programmed mitochondrial clearance during reticulocyte maturation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104（49）：19500-19505.

[25]Kanzawa T,Zhang L,Xiao L,et al.Arsenic trioxide induces autophagic cell death in malignant glioma cells by upregulation of mitochondrial cell death protein BNIP3[J].Oncogene,2005,24（6）：980-991.