馬 龍，姚 晗，孫蘭萍，許 暉

(蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000)

超聲波輔助提取杜仲翅果桃葉珊瑚甙工藝優(yōu)化

馬 龍，姚 晗，孫蘭萍，許 暉

(蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000)

目的：研究超聲波輔助提取杜仲翅果中桃葉珊瑚甙的較佳工藝條件，為杜仲翅果資源的綜合開發(fā)利用提供參考。方法：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波功率、提取時(shí)間及液料比等因素的最佳工藝條件。結(jié)果：超聲波輔助提取杜仲翅果中桃葉珊瑚甙的最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)72.1%、超聲波功率300W，提取時(shí)間20.5min、液料比12.3∶1(mL/g)，在該條件下杜仲翅果桃葉珊瑚甙的實(shí)際提取率為5.91%。在試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對(duì)桃葉珊瑚甙得率影響大小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間。結(jié)論：超聲波輔助提取法能夠較好地提取杜仲翅果桃葉珊瑚甙。

杜仲翅果；桃葉珊瑚甙；超聲波輔助提??；響應(yīng)曲面法

杜仲(Eucommia ulmoides Oilv.)多年生落葉喬木植物，杜仲科杜仲屬，被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物，是我國(guó)特有的名貴經(jīng)濟(jì)樹種和貴重的中藥材[1]。桃葉珊瑚甙是一種環(huán)烯醚萜甙類化合物，具有護(hù)肝解毒[2]、抗炎[3]、抗氧化[4]、抗衰老[5]、抗骨質(zhì)疏松[6]及抗腫瘤[7]等眾多藥理活性，在杜仲中含量豐富，分布于杜仲各部位，張康健等[8]對(duì)杜仲中藥用活性成分進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn)杜仲翅果是杜仲各部位中桃葉珊瑚甙含量最多的部位。

目前，桃葉珊瑚甙的傳統(tǒng)提取方法多采用加熱浸提法，但是桃葉珊瑚甙為C4去甲基環(huán)烯醚萜化合物，對(duì)熱敏感，易氧化分解，高溫和長(zhǎng)時(shí)間加熱都不利于其提取[9]。為了減少桃葉珊瑚甙在提取過(guò)程中由于溫度造成的損失，一些學(xué)者嘗試使用了超聲波提取技術(shù)[10]、超臨界CO2萃取技術(shù)[11]、酶法提取技術(shù)[12]、微波提取技術(shù)[13-14]等先進(jìn)的提取技術(shù)從杜仲不同部位提取桃葉珊瑚甙，均取得了較好的提取效果。超聲波輔助提取技術(shù)是一種新的提取分離技術(shù)，與傳統(tǒng)提取方法相比具有高效、省時(shí)、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取?？紤]到杜仲翅果果仁周圍緊密地包附有薄翅，難以分離，本實(shí)驗(yàn)直接以杜仲翅果為原料進(jìn)行提取[15]，采用超聲波輔助提取技術(shù)，利用響應(yīng)曲面法對(duì)杜仲翅果中桃葉珊瑚甙的提取工藝進(jìn)行研究，探討較佳工藝流程，為杜仲翅果的開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

杜仲翅果(帶殼粉碎，索氏抽提脫脂脫膠，60℃烘干，過(guò)40目篩備用) 陜西省略陽(yáng)縣杜仲開發(fā)中心。

桃葉珊瑚甙標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所；Epstahl試劑(對(duì)二甲氨基苯甲醛0.25g，冰醋酸50g，35%磷酸5g，水20mL)、石油醚、甲醇、乙醇、鹽酸等均為分析純。

752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；JP300超聲波萃取器 武漢嘉鵬電子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

杜仲翅果→粉碎→脫油脫膠→干燥→過(guò)篩→提取→過(guò)濾→提取液→測(cè)定含量

1.2.2 單因素試驗(yàn)

分別以乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波功率、提取時(shí)間和液料比為因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率的影響，確定各因素的變化范圍。

1.2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比為試驗(yàn)因素，以杜仲翅果桃葉珊瑚甙得率為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)，優(yōu)化杜仲翅果桃葉珊瑚甙提取工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Factors and their levels in Box-Behnken experimental design

1.2.4 桃葉珊瑚甙含量的測(cè)定

1.2.4.1 桃葉珊瑚甙標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[16]

精確稱取桃葉珊瑚甙標(biāo)準(zhǔn)品5.4mg，用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度0.54mg/mL的桃葉珊瑚苷甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取該溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL于10mL比色管中，依次加入1.7mL Epstahl試劑、0.5mL 20%鹽酸、2.5mL 95%乙醇，加蒸餾水定容至刻度，在75℃水浴中顯色20min，冷卻10min后于波長(zhǎng)596nm處測(cè)定其吸光度，以試劑空白作參比。桃葉珊瑚甙質(zhì)量濃度(X，μg/mL)與吸光度(Y)的線性回歸方程：Y=0.0161X＋0.0332，R2=0.9954。

1.2.4.2 樣品中桃葉珊瑚甙含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取濃度適宜的樣品溶液1.00mL于10mL比色管中，依次加入1.7mL Epstahl試劑、0.5mL 20%鹽酸、2.5mL 95%乙醇，加蒸餾水定容至刻度，在75℃水浴中顯色20min，冷卻10min后，于波長(zhǎng)596nm處測(cè)定其吸光度，以試劑空白作參比。對(duì)照桃葉珊瑚苷質(zhì)量濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣品溶液中桃葉珊瑚苷質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

稱取經(jīng)預(yù)處理的杜仲翅果粉1g，按液料比10∶1，分別加入體積分?jǐn)?shù)0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇水溶液，在超聲波功率300W條件下處理15min，測(cè)杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率。提取劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的關(guān)系曲線如圖1所示。

圖1 提取劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)桃葉珊瑚甙得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of aucubin

從圖1可以看出，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在0～70%范圍內(nèi)時(shí)，桃葉珊瑚甙的得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而升高，并在70%時(shí)達(dá)到最大值；乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)70%時(shí)，得率開始大幅下降，而且提取液開始變渾濁，說(shuō)明有較多醇溶性物質(zhì)溶出，提取效果降低。因此選擇較佳的乙醇水溶液體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.1.2 超聲波功率對(duì)提取效果的影響

稱取經(jīng)預(yù)處理的杜仲翅果粉1g，按液料比10∶1，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇水溶液，分別在超聲波功率60、120、180、240、300W條件下處理15min，測(cè)定杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率。超聲波功率對(duì)得率的關(guān)系曲線如圖2所示。

圖2 超聲波功率對(duì)桃葉珊瑚甙得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of aucubin

從圖2可以看出，桃葉珊瑚甙得率隨著超聲波功率的增加而增加。這是因?yàn)槌暡üβ试酱?，所產(chǎn)生的空穴作用和機(jī)械攪拌作用越強(qiáng)烈，分子擴(kuò)散速度也越大，桃葉珊瑚甙滲出就越快。由于本實(shí)驗(yàn)所使用的超聲波萃取器的最大功率為300W，根據(jù)曲線趨勢(shì)桃葉珊瑚甙的得率還可能繼續(xù)增大，超聲波功率300W并不一定是最佳條件，故超聲波功率因素不帶入Box-Behnken試驗(yàn)。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

稱取經(jīng)預(yù)處理的杜仲翅果粉1g，按液料比10∶1，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇水溶液，在超聲波功率300W條件下分別處理10、20、30、40、50、60min，測(cè)定杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率。提取時(shí)間對(duì)得率的關(guān)系曲線如圖3所示。

圖3 提取時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of aucubin

從圖3可以看出，超聲波處理20min的桃葉珊瑚甙得率明顯高于處理10min的得率，這可能是由于超聲波對(duì)杜仲翅果組織結(jié)構(gòu)的破壞作用不斷加大，溶出物多，得率也高；但是超聲波處理超過(guò)20min后，桃葉珊瑚甙得率不但不再增加，反而顯著下降，主要原因可能是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液體系的溶質(zhì)濃度逐漸達(dá)到了平衡，同時(shí)持續(xù)的超聲波作用使溶出的部分桃葉珊瑚甙的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞。因此選取較佳的提取時(shí)間為20min。

2.1.4 液料比對(duì)提取效果的影響

稱取經(jīng)預(yù)處理的杜仲翅果粉1g，分別按液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇水溶液，在超聲波功率300W的條件下處理20min，測(cè)定杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率。液料比對(duì)得率的關(guān)系曲線如圖4所示。

圖4 液料比對(duì)桃葉珊瑚甙得率的影響Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on extraction yield of aucubin

從圖4可知，隨著溶劑用量的增加，桃葉珊瑚甙得率逐漸升高。當(dāng)液料比在5∶1～15∶1范圍內(nèi)時(shí)，桃葉珊瑚甙得率上升較快；但當(dāng)液料比超過(guò)15∶1時(shí)，得率增長(zhǎng)趨勢(shì)比較平緩，基本持平。這可能是因?yàn)槌暡ㄝo助提取實(shí)質(zhì)上也是溶質(zhì)萃取過(guò)程，根據(jù)擴(kuò)散定律可知，隨著溶劑用量的增加，杜仲翅果粉與溶劑接觸面的濃度差增大，從而提高了溶質(zhì)與溶劑的擴(kuò)散速度，提取率增大；隨著杜仲翅果粉中桃葉珊瑚甙的不斷溶出，導(dǎo)致濃度差下降，擴(kuò)散速度減小，逐漸達(dá)到平衡狀態(tài)。由于杜仲翅果中桃葉珊瑚甙的含量是一定的，當(dāng)溶劑用量過(guò)大時(shí)，會(huì)造成溶劑浪費(fèi)，增加后續(xù)濃縮工序的負(fù)荷，基于降低生產(chǎn)成本考慮，因此選擇較佳的液料比為15∶1 (mL/g)。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

2.2.1 回歸模型的擬合與檢驗(yàn)

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果、方差分析和參數(shù)估計(jì)及顯著性分析分別見(jiàn)表2～4，試驗(yàn)按隨機(jī)順序進(jìn)行。

運(yùn)用Minitab15統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，獲得桃葉珊瑚甙得率對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

Y=5.85＋0.25Xl＋0.10X2＋0.18X3-0.42Xl2-0.26X22-0.15X32-0.06XlX2-0.09XlX3＋0.01X2X3

表3表明，二次回歸模型的F值=106.53＞F0.01(9,5)= 10.15及F0.05(9,5)= 4.77，相應(yīng)的P＜0.0001，該方差的模型達(dá)到極其顯著；而失擬項(xiàng)的F值=2.61＜F0.05(3,2)=19.16，其相應(yīng)的P=0.289，表明失擬性差異不顯著，該回歸方差無(wú)失擬因素存在，符合模型要求?；貧w診斷結(jié)果說(shuō)明該二次回歸模型擬合效果很好，其決定系數(shù)r2=1.75/1.77=0.9887，具有高度的相關(guān)性，表明模型的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合優(yōu)度，故模型成立。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding predicted and experimental values of extraction yield of aucubin

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of the predictive model for extraction yield of aucubin

表4 回歸方程參數(shù)估計(jì)及顯著性分析Table 4 Coefficient estimate and significance of each term of the predictive model for extraction yield of aucubin

為利用二次多項(xiàng)式回歸模型方程獲得優(yōu)化值，根據(jù)表4中回歸方程參數(shù)顯著性分析結(jié)果剔除未達(dá)到0.25以上顯著水平的因素，得到修正后的回歸方程為：

Y = 5.85 + 0.25Xl＋0.10X2＋0.18X3-0.42X12-0.26X22-0.15X32-0.06XlX2-0.09X1X3

修正后的二次回歸模型的F值提高至137.77，失擬項(xiàng)的F值下降至2.06，決定系數(shù)r2提高至0.9946，故新的回歸方程擬合效果進(jìn)一步提高。

2.2.2 主效應(yīng)分析

從表3和表4可以看出，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的X1X3對(duì)響應(yīng)值有顯著或極顯著影響，即乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的交互作用對(duì)得率產(chǎn)生顯著的影響。

回歸方程參數(shù)顯著性分析的t值可以反映出各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的重要性，∣t∣值越大，表明對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，即重要性越大。從表4可知，各試驗(yàn)因素的影響程度從大到小排列依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取時(shí)間。

2.2.3 響應(yīng)面分析

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)桃葉珊瑚甙得率的曲面圖及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of ethanol concentration and extraction time on extraction yield of aucubin

多元回歸方程的響應(yīng)曲面圖及及等高線圖見(jiàn)圖5～7。通過(guò)對(duì)該組動(dòng)態(tài)圖的分析即可對(duì)各因素及任意兩因素之間的交互作用影響得率的效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。等高線圖的形狀可以反映出兩因素間交互作用的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示二者交互作用顯著，而圓形則表示二者交互作用不顯著。從圖5和圖7中可以直觀地看出乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間、提取時(shí)間和液料比對(duì)杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率的交互作用不顯著，與統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果相符。從圖6中可以看出乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對(duì)杜仲翅果中桃葉珊瑚甙得率的交互作用顯著。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對(duì)桃葉珊瑚甙得率的曲面圖及等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of ethanol concentration and solid/liquid ratio on extraction yield of aucubin

圖7 提取時(shí)間和液料比對(duì)桃葉珊瑚甙得率的曲面圖及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the effects of extraction time and solid/liquid ratio on extraction yield of aucubin

2.2.4 二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型尋優(yōu)與驗(yàn)證

對(duì)修正后的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型方程解逆矩陣，得到杜仲翅果桃葉珊瑚甙的超聲波輔助提取的較優(yōu)最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)72.1%、提取時(shí)間20.5min、液料比12.3∶1(mL/g)，在該工藝條件下得率的預(yù)測(cè)值為5.94%。

為了驗(yàn)證所得結(jié)論的正確性，選擇響應(yīng)曲面法優(yōu)化所得到的工藝參數(shù)進(jìn)行進(jìn)行杜仲翅果桃葉珊瑚甙得率的對(duì)照試驗(yàn)，得率的實(shí)際值為5.91%，二者相對(duì)誤差僅0.5%，說(shuō)明試驗(yàn)優(yōu)化得到的工藝參數(shù)基本是可靠的。

3 結(jié) 論

利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到超聲波輔助提取杜仲翅果桃葉珊瑚甙的較佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)72.1%、超聲波功率300W、提取時(shí)間20.5min、液料比12.3∶1(mL/g)，在該條件下，杜仲翅果桃葉珊瑚甙的提取率為5.91%。超聲波輔助法提取杜仲翅果桃葉珊瑚甙具有收率高、節(jié)省溶劑、生產(chǎn)周期短、有效成分不易被破壞等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景十分廣闊。

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Process Optimization for Ultrasonic-assisted Extraction of Aucubin from Eucommia ulmoides Oliv. Key Fruits

MA Long，YAO Han，SUN Lan-ping，XU Hui
(Department of Biotechnology and Food Engineering, Bengbu College, Bengbu 233000, China)

Objective∶ To optimize the conditions for ultrasonic-assisted extraction of aucubin from Eucommia ulmoides Oliv. key fruits. Methods∶ One-factor-at-a-time method and response surface methodology based on Box-Behnken experimental design were used for process conditions optimization. Results∶ The optimal extraction conditions were 72.1% aqueous ethanol solution as the extraction solvent, ultrasonic power of 300 W, extraction time of 20.5 min and solid/liquid ratio of 12.3∶1 (mL/g). Under these conditions, the extraction yield of aucubin was observed to be 5.91%. Ethanol concentration had the largest impact on the extraction yield of aucubin, followed by solid/liquid ratio and extraction time. Conclusion∶ Ultrasonic assistance can enhance the extraction of aucubin from Eucommia ulmoides Oliv. key fruits.

Eucommia ulmoides Oliv. key fruits；aucubin；ultrasonic wave-assisted extraction；response surface methodology

R284.2

A

1002-6630(2011)16-0080-05

2010-10-26

安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2011Z240)；安徽省高等學(xué)校省級(jí)食品科學(xué)與工程特色專業(yè)建設(shè)點(diǎn)資助項(xiàng)目(20101091)；安徽省食品科學(xué)與工程教學(xué)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(20101094)

馬龍(1979—)，男，講師，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：malongbb@163.com