張琳靜，于國(guó)萍*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

木瓜蛋白酶水解大豆?jié)饪s蛋白及糖基化修飾對(duì)水解產(chǎn)物溶解性的影響

張琳靜，于國(guó)萍*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

為提高大豆?jié)饪s蛋白(soy protein concentrate，SPC)在等電點(diǎn)處的溶解性，采用木瓜蛋白酶對(duì)大豆?jié)饪s蛋白進(jìn)行酶解，形成可溶性大豆蛋白，然后將其與葡聚糖進(jìn)行糖基化反應(yīng)，形成親水的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物。結(jié)果表明：大豆?jié)饪s蛋白酶解最佳條件為大豆蛋白與水質(zhì)量配比5∶100、酶添加量10000U/g、反應(yīng)溫度55～60℃；糖基化最佳條件為葡聚糖與蛋白配比1∶1、反應(yīng)時(shí)間3.5h；大豆?jié)饪s蛋白在等電點(diǎn)附近(pH4)的氮溶指數(shù)由原來(lái)的9.53%提高到39.12%。本實(shí)驗(yàn)制備的等電點(diǎn)可溶大豆蛋白，可增加其在中等酸度食品中的應(yīng)用。

大豆?jié)饪s蛋白；木瓜蛋白酶；糖基化；溶解性

大豆蛋白制品主要有3種——脫脂大豆粉、大豆?jié)饪s蛋白(soy protein concentrate，SPC)、大豆分離蛋白。大豆蛋白在其等電點(diǎn)兩側(cè)溶解度較高，但是等電點(diǎn)附近溶解度最低，這一定程度上影響了大豆蛋白的凝膠性、乳化性、持水性等功能性質(zhì)。特別是大豆?jié)饪s蛋白在制備過(guò)程中受熱變性或醇變性，導(dǎo)致其溶解性更差。通常采用物理、化學(xué)和生物學(xué)方法，使大豆蛋白氨基酸殘基和多肽鏈發(fā)生變化，以提高其溶解性[1]。Jambrak等[2]利用超聲波處理大豆蛋白，經(jīng)20kHz處理后，大豆分離蛋白和大豆?jié)饪s蛋白的溶解性都有顯著提高。Tang等[3]發(fā)現(xiàn)超高壓尤其是400、600MPa處理大豆分離蛋白，可以使不溶的聚集物轉(zhuǎn)化成可溶的聚集物。酶解是大豆蛋白增溶改性常用的生物學(xué)方法，經(jīng)蛋白酶水解后的大豆蛋白溶解性顯著改善：Lamsal等[4]發(fā)現(xiàn)大豆?jié)饪s蛋白經(jīng)限制性酶解后溶解性提高，在等電點(diǎn)附近溶解度提高了接近20%；使用Alcalase作為改性大豆蛋白的酶制劑，可以使醇法大豆?jié)饪s蛋白的溶解度增大[5]；也有研究發(fā)現(xiàn)大豆?jié)饪s蛋白經(jīng)胰蛋白酶修飾至水解度為1%，可以顯著提高修飾產(chǎn)品的溶解性和保水性[6]。將大豆蛋白與多羥基的化合物進(jìn)行復(fù)合，即糖基化反應(yīng)可以提高大豆蛋白的溶解性，等電點(diǎn)附近也呈現(xiàn)較好的溶解性：陳中等[7]將蛋白質(zhì)充分糖基化后制備了一種高穩(wěn)定性的酸性蛋白飲料；將葡聚糖10萬(wàn)和乳清蛋白進(jìn)行美拉德反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)蛋白在酸性條件下的溶解度提高、熱穩(wěn)定性增強(qiáng)[8]；而通過(guò)干熱接枝反應(yīng)制備的糖苷化蕓豆蛋白，也能顯著改善蕓豆蛋白的溶解度[9]；酪蛋白-葡聚糖接枝物在酸性范圍內(nèi)，隨著接枝度的增大，溶解度不斷增大，在等電點(diǎn)附近，濕法和干法接枝物的溶解度分別提高至40%和30%左右[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合生物學(xué)方法(酶水解)和化學(xué)方法(糖基化)對(duì)大豆?jié)饪s蛋白進(jìn)行修飾，確定大豆?jié)饪s蛋白酶解及糖基化條件，為提高大豆?jié)饪s蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其是等電點(diǎn)附近高溶解性產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆?jié)饪s蛋白(蛋白質(zhì)含量為51.41%) 大慶日月星公司；木瓜蛋白酶 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡聚糖(分子質(zhì)量2×104u) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HYP-1014消化爐 上海纖檢儀器有限公司；LNK-871凱氏定氮儀 江蘇省宜興市科教儀器研究所；FE20 pH計(jì) 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；BIO-RAD垂直電泳槽 伯樂(lè)生命科學(xué)研究發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氮溶指數(shù)測(cè)定

稱(chēng)取大豆?jié)饪s蛋白0.20g，放入消化管中，按照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的微量凱氏定氮法測(cè)定其蛋白含量，為總氮含量。稱(chēng)取大豆?jié)饪s蛋白15.00g，常溫溶解于300mL蒸餾水中，電動(dòng)攪拌30min，然后轉(zhuǎn)移至離心管中，3000r/min離心10min，取上清液10mL，放入消化管中，按照GB/T 5009.5—2003中的微量凱氏定氮法測(cè)定其蛋白含量，為可溶性氮含量。氮溶指數(shù)定義如下：

1.3.2 木瓜蛋白酶比活力的測(cè)定

目前國(guó)內(nèi)通用的蛋白酶的活力單位定義為1min水解出1μg酪氨酸的酶量稱(chēng)為1U。參照參考文獻(xiàn)[11]，測(cè)得木瓜蛋白酶的比活力為320U/mg。

1.3.3 木瓜蛋白酶水解最佳條件的優(yōu)化

配制一定大豆蛋白與水質(zhì)量配比的大豆?jié)饪s蛋白溶液，用1mol/L NaOH溶液將蛋白溶液pH值調(diào)至7.0，于不同溫度下加入木瓜蛋白酶水解30min。反應(yīng)過(guò)程中使用pH計(jì)，通過(guò)滴加NaOH溶液，保持酶解反應(yīng)體系的pH值穩(wěn)定在7.0。水解完成后，將水解液煮沸10min使酶失活。

通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定大豆蛋白與水質(zhì)量配比、酶添加量、溫度等因素對(duì)氮溶指數(shù)的影響，確定最佳酶解反應(yīng)條件。

1.3.4 大豆蛋白糖基化條件的優(yōu)化

在確定的最佳條件下進(jìn)行水解，然后向酶解后的大豆?jié)饪s蛋白體系中添加合適比例的葡聚糖，置于95℃水浴中攪拌反應(yīng)，一定時(shí)間后置于涼水浴冷卻，停止反應(yīng)。將溶液pH值調(diào)至4，離心取上清液。以氮溶指數(shù)為指標(biāo)，確定最佳糖基化條件。

1.3.5 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)

選擇5%的濃縮膠和15%的分離膠，蛋白進(jìn)樣量為4μL。電泳開(kāi)始時(shí)電壓為80mV左右，蛋白進(jìn)入分離膠后，改為120mV。觀(guān)察酶解及糖基化修飾前后大豆?jié)饪s蛋白分子質(zhì)量分布情況及結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶水解條件的優(yōu)化

2.1.1 大豆蛋白與水質(zhì)量配比對(duì)SPC氮溶指數(shù)的影響

圖1 大豆蛋白與水質(zhì)量配比對(duì)SPC氮溶指數(shù)的影響Fig.1 Effect of SPC concentration on NSI

如圖1所示，未處理的SPC在低大豆蛋白與水質(zhì)量配比(1∶100、2∶100)時(shí)氮溶指數(shù)較低，但變化不顯著(P＜0.05)；隨著大豆蛋白與水質(zhì)量配比升高，氮溶指數(shù)升高；當(dāng)大豆蛋白與水質(zhì)量配比過(guò)高(5∶100、6∶100)時(shí)，過(guò)量的蛋白發(fā)生聚沉，氮溶指數(shù)下降。酶水解后的SPC氮溶指數(shù)有大幅提高，大豆蛋白與水質(zhì)量配比較低(1∶100、2∶100)時(shí)，大豆蛋白分散體系較開(kāi)闊，有利于酶充分作用于底物，因此氮溶指數(shù)提高較大，但是水解過(guò)程中底物濃度太低，不利于進(jìn)一步利用，因此大豆蛋白與水質(zhì)量配比確定為5∶100比較適宜。

2.1.2 酶添加量對(duì)SPC氮溶指數(shù)的影響

如圖2所示，隨著酶添加量逐漸增大，SPC氮溶指數(shù)逐漸提高，這是由于酶將大分子的不溶性蛋白水解成了小分子的可溶性肽段和氨基酸，底物充足時(shí)，酶添加量越大，水解后生成的可溶性肽比例越高，氮溶指數(shù)就越高。當(dāng)酶添加量為10000U/g時(shí)，氮溶指數(shù)由水解前的76.56%提高到96.66%，當(dāng)酶添加量為12000U/g時(shí)，氮溶指數(shù)提高到96.69%，二者差異并不顯著(P＜0.05)。說(shuō)明當(dāng)酶添加量達(dá)到一定水平后，底物已被酶所飽和，反應(yīng)速度達(dá)到最大，再增大酶添加量，水解度增加將不明顯[12]。因此選擇酶添加量為10000U/g。

圖2 酶添加量對(duì)SPC氮溶指數(shù)的影響Fig.2 Effect of papain amount on NSI of SPC

2.1.3 酶解反應(yīng)溫度對(duì)SPC氮溶指數(shù)的影響

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)SPC氮溶指數(shù)的影響Fig.3 Effect of temperature on NSI of SPC

隨著反應(yīng)溫度升高，氮溶指數(shù)逐漸提高。當(dāng)酶水解溫度保持在55～60℃時(shí)，SPC氮溶指數(shù)最高。溫度繼續(xù)上升，氮溶指數(shù)緩慢下降。溫度偏低或偏高都不利于酶發(fā)揮最高活力[11]，因此反應(yīng)溫度選擇在55～60℃。

選擇大豆蛋白與水質(zhì)量配比5∶1 0 0、酶添加量10000U/g、反應(yīng)溫度55～60℃進(jìn)行酶水解反應(yīng)，產(chǎn)物用于進(jìn)一步糖基化反應(yīng)。

2.2 優(yōu)化酶解條件下SPC的氮溶指數(shù)

在優(yōu)化條件下對(duì)SPC進(jìn)行處理，檢測(cè)酶解前后SPC氮溶指數(shù)隨pH值的變化情況。如圖4所示，酶解后SPC氮溶指數(shù)普遍提高，一些pH值條件下氮溶指數(shù)接近100%。但是在pH4～6附近氮溶指數(shù)仍舊較低，與其他pH值條件下相差較大，這影響了其在中等酸度食品中的應(yīng)用。為提高大豆?jié)饪s蛋白等電點(diǎn)附近的溶解性，試驗(yàn)對(duì)酶解大豆蛋白繼續(xù)進(jìn)行改性，即糖基化修飾。

圖4 pH值對(duì)SPC氮溶指數(shù)的影響Fig.4 Effect of pH value on NSI of SPC

2.3 大豆蛋白糖基化條件的優(yōu)化

2.3.1 葡聚糖與蛋白配比對(duì)糖基化大豆蛋白氮溶指數(shù)的影響

圖5 葡聚糖與蛋白配比對(duì)糖基化大豆蛋白氮溶指數(shù)的影響Fig.5 Effect of dextran amount on NSI of SPC

如圖5所示，隨著葡聚糖與蛋白配比的提高，它與肽分子之間碰撞的幾率大大增加，有利于反應(yīng)的進(jìn)行。葡聚糖與蛋白配比0.5∶1～1∶1時(shí)，氮溶指數(shù)較高。但是，葡聚糖與蛋白配比增加到一定程度，由于肽分子和多糖分子的空間位阻，分子之間的碰撞幾率會(huì)減少，不利于反應(yīng)的進(jìn)行[9]。由于多糖鏈的引入，多羥基的親水性使蛋白質(zhì)在pH4(等電點(diǎn)附近)溶解性得到提高，由25.90%提高到39.12%。葡聚糖量少時(shí)，形成的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物親水基不足以保證蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)的穩(wěn)定性；葡聚糖量大時(shí)，由于大分子多糖形成的空間位阻也降低了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

2.3.2 糖基化時(shí)間對(duì)糖基化大豆蛋白氮溶指數(shù)的影響

圖6 糖基化時(shí)間對(duì)糖基化大豆蛋白氮溶指數(shù)的影響Fig.6 Effect of glycosylation time on NSI of SPC

隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈氨基與多糖分子的末端不飽和羰基反應(yīng)逐漸形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，形成以多羥基多糖部分為親水基，蛋白質(zhì)部分為疏水基的大分子，多糖與蛋白質(zhì)受熱逐步結(jié)合，反應(yīng)程度逐漸提高。但是反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)過(guò)度伸展，增加蛋白質(zhì)間的相互作用增加，以及多糖的空間阻礙，導(dǎo)致凝聚和沉淀，蛋白質(zhì)氮溶指數(shù)下降。

2.4 SDS-PAGE

圖7 大豆?jié)饪s蛋白酶解及糖基化修飾產(chǎn)物電泳圖Fig.7 SDS-PAGE of SPC, SPC hydrolysate and glycosylated SPC hydrolysate

由圖7可以看出，酶解后蛋白質(zhì)分子質(zhì)量下降，形成了可溶性低分子質(zhì)量多肽；糖基化后，上部較大分子質(zhì)量條帶減少，而分離膠頂端出現(xiàn)一條明顯的大分子條帶，說(shuō)明多肽與葡聚糖產(chǎn)生了聚合，可溶部分蛋白分子質(zhì)量增大。

3 結(jié) 論

木瓜蛋白酶水解大豆?jié)饪s蛋白的最佳條件是大豆蛋白與水質(zhì)量配比5∶100、酶添加量10000U/g、反應(yīng)溫度55～60℃。經(jīng)此處理在各pH值條件下，酶解后SPC氮溶指數(shù)普遍提高。大豆蛋白糖基化的最佳條件是葡聚糖與蛋白配比1∶1、反應(yīng)時(shí)間3.5h。經(jīng)木瓜蛋白酶水解及糖基化修飾后大豆?jié)饪s蛋白在pH4的氮溶指數(shù)由9.53%提高至39.12%。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)大豆?jié)饪s蛋白溶解性的提高進(jìn)行了嘗試，尤其是其在pH4時(shí)的溶解度得到了顯著改善。但是對(duì)大豆?jié)饪s蛋白增溶的分子機(jī)理研究還不透徹，需要在今后的研究中進(jìn)一步探討。

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Effect of Papain Hydrolysis and Glycosylation on Solubility of Soybean Protein Concentrate

ZHANG Lin-jing，YU Guo-ping*
(School of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In order to increase the solubility of soybean protein concentrate (SPC) at the isoelectric point, SPC was hydrolyzed by papain to form soluble protein and then glycosylated with dextran to form a hydrophilic protein-polysaccharide complex. The best hydrolysis conditions of SPC were determined as follows∶ SPC concentration 5%, papain concentration 10000 U/g, and temperature 55-60 ℃. The best glycosylation was achieved after 3.5 h of reaction at a dextran/SPC ratio 1∶1. As a result, the nitrogen solubility index of SPC near the isoelectric point increased from 9.53% to 39.12%. The obtained soybean protein soluble at the isoelectric point can have more applications in moderately acidic foods.

soy protein concentrate；papain；glycosylation；solubility

TS201.2

A

1002-6630(2011)16-0001-04

2010-09-28

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z322)；哈爾濱科技創(chuàng)新人才研究專(zhuān)項(xiàng)(2006RFQXN014)

張琳靜(1986—)，女，碩士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：zlj1986112@126.com

*通信作者：于國(guó)萍(1963—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：yuguopingneau@hotmail.com