許巧情,郝立平

(1.長江大學(xué)長江中游濕地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心,湖北荊州434025;2.湖北信息工程學(xué)校,湖北荊門448124)

不同育齡三角帆蚌血細(xì)胞吞噬率和血漿抗菌活力的比較

許巧情1,郝立平2

(1.長江大學(xué)長江中游濕地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心,湖北荊州434025;2.湖北信息工程學(xué)校,湖北荊門448124)

以2～5育齡三角帆蚌Hyriopsis cumingii為對(duì)象,研究了三角帆蚌血漿對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌、嗜水氣單胞菌的抗菌活力和血細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌的吞噬率。結(jié)果表明:4種育齡的育珠蚌血漿對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活力最強(qiáng),其次為溶壁微球菌、大腸桿菌和嗜水氣單胞菌,其中3齡育珠蚌對(duì)4種細(xì)菌的抗菌活力最強(qiáng);4齡育珠蚌對(duì)金黃色葡萄球菌的吞噬率最高,達(dá)到36.6%,吞噬指數(shù)達(dá)到3.75,其次為5齡育珠蚌,2齡育珠蚌對(duì)金黃色葡萄球菌的吞噬率最低,僅為25.2%,吞噬指數(shù)為2.95。本研究結(jié)果證實(shí):在2～5育齡內(nèi),3～4育齡的三角帆蚌育珠蚌的吞噬率和抗菌活力最強(qiáng),抵抗外來病原菌的能力最高;但隨著育珠年齡的增長,三角帆蚌免疫能力不斷下降,因而養(yǎng)蚌育珠過程中要加強(qiáng)對(duì)高齡蚌抗病防病能力的管理。

三角帆蚌;抗菌活力;吞噬率

中國養(yǎng)殖三角帆蚌Hyriopsis cumingii的歷史悠久,是淡水珍珠生產(chǎn)大國。自20世紀(jì)80年代末以來,淡水珍珠產(chǎn)量不斷提高,2004年珍珠產(chǎn)出量約1 250 t,占世界珍珠產(chǎn)量的90%以上[1]。近年來,中國主要的淡水育珠蚌——三角帆蚌暴發(fā)了大規(guī)模的病害,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,因而三角帆蚌的免疫防御機(jī)制研究顯得尤為重要。軟體動(dòng)物血清中含有的抗菌因子,在抵御水體中病原微生物的入侵、抑制和消滅已入侵的病原微生物等方面起著積極作用,是機(jī)體免疫防御的重要屏障之一[2-3]。有關(guān)軟體動(dòng)物血清/血漿抗菌作用的研究報(bào)道較少,國外僅見關(guān)于牡蠣[4]、紫貽貝[5]、雙瓣類免疫因子[6]的報(bào)道,國內(nèi)有關(guān)于櫛孔扇貝[7]、毛蚶[8]的報(bào)道,但尚未見對(duì)三角帆蚌血清/血漿抗菌作用的報(bào)道。本研究中,作者研究了不同育齡三角帆蚌血細(xì)胞的吞噬活性,并對(duì)其血漿的抗菌活力進(jìn)行了比較,旨在為三角帆蚌免疫機(jī)能的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2009年11月5日在荊州市公安縣一珍珠養(yǎng)殖場采集不同育齡的三角帆蚌100多只,在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)5 d后用于試驗(yàn)。三角帆蚌尺寸的測定結(jié)果見表1。

1.2 方法

1.2.1 血清和血細(xì)胞的分離 活體解剖,小心切斷三角帆蚌的閉殼肌,在貝殼最高處找到正在跳動(dòng)的心臟,用1 mL注射器從心臟中抽取血液。對(duì)于4～5齡蚌每3只蚌的血液混合收集在一管,對(duì)于2～3齡小蚌每6～8只蚌的血液混合收集在一管,這兩種三角帆蚌血液分別收集3管。4℃下以1 500 r/min離心15 min,收集上層的血漿和下層的血細(xì)胞,向血細(xì)胞中加入等體積的抗凝劑。

1.2.2 細(xì)菌懸液的制備 分別取少量大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、溶壁微球菌在LB固體培養(yǎng)基上用接種環(huán)劃線接種,在37℃下培養(yǎng)16～18 h后,分別挑取4種細(xì)菌的單克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)16～18 h,離心,收集底部的菌液即為細(xì)菌懸液。用磷酸緩沖液將細(xì)菌懸液調(diào)至試驗(yàn)所需的細(xì)菌濃度。

1.2.3 抗菌活力的測定 取大腸桿菌Escherichia

coli懸液50 μL與等體積的三角帆蚌血清置于同一離心管中,22℃下水浴中振蕩培養(yǎng)2 h;取50 μL培養(yǎng)液與300 μL磷酸緩沖溶液混勻,得到稀釋溶液;取稀釋溶液300 μL均勻涂布于3個(gè)LB固體培養(yǎng)平板上,每個(gè)平板上涂布100 μL。取大腸桿菌懸液50 μL與等體積的磷酸緩沖液按照上述方法試驗(yàn),作為對(duì)照組。將所有LB固體平板置于37℃下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h,統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)平板上的細(xì)菌個(gè)數(shù),取其平均值?？咕盍Φ挠?jì)算公式為

抗菌率=(對(duì)照組細(xì)菌數(shù)量-試驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)量)/對(duì)照組細(xì)菌數(shù)量×100%。

以同樣的方法測定三角帆蚌血清對(duì)金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus和嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila的抗菌活力。

1.2.4 吞噬率的測定 分別取50 μL不同育齡的三角帆蚌育珠蚌血細(xì)胞和等體積的金黃色葡萄球菌菌液加入同一離心管中,25℃下水浴中作用45 min后立即涂片(每組做3個(gè)重復(fù)),用吉姆薩染色,油鏡下觀察,并依據(jù)以下公式計(jì)算吞噬活性:

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

不同育齡三角帆蚌血漿的抗菌活力和血細(xì)胞的吞噬活力的比較均采用Duncan's多重比較分析,以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 三角帆蚌血漿的抗菌活力

由圖1可見:2～5育齡的三角帆蚌血漿對(duì)金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌均表現(xiàn)出一定程度的抗菌活性,而且對(duì)兩種革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌)的抗菌活性要高于對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌和嗜水氣單胞菌)。3育齡的三角帆蚌對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活力要明顯地高于其它育齡的三角帆蚌(P＜0.05),其抗菌率達(dá)到68.7%,2、4、5育齡的三角帆蚌對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活力差異不明顯(P＞0.05);4種育齡的三角帆蚌對(duì)金黃色葡萄球菌的平均抗菌率為56.1%。3、4、5育齡的三角帆蚌對(duì)溶壁微球菌的抗菌活力存在明顯差異(P＜0.05),其中3育齡的三角帆蚌對(duì)溶壁微球菌的抗菌活力最高,抗菌率達(dá)59.2%;4種育齡的三角帆蚌對(duì)溶壁微球菌的平均抗菌率為47%。3、4育齡的三角帆蚌對(duì)大腸桿菌的抗菌活力要明顯高于2、5育齡的三角帆蚌(P＜0.05),但3、4育齡之間, 2、5育齡之間差異不顯著(P＞0.05);4種育齡的三角帆蚌對(duì)大腸桿菌的平均抗菌率為41.7%。類似地,3、4育齡三角帆蚌對(duì)嗜水氣單胞菌的抗菌活性比5育齡的三角帆蚌要高(P＜0.05),但2育齡三角帆蚌與5育齡三角帆蚌之間差異不顯著(P＞0.05);不同育齡的三角帆蚌對(duì)嗜水氣單胞菌的抗菌活力最低,平均抗菌率為30.4%。

2.2 三角帆蚌血細(xì)胞的吞噬活性

從圖2可見:2育齡三角帆蚌血細(xì)胞的吞噬率很低,僅為25.2%,明顯低于4育齡和5育齡的三角帆蚌(P＜0.05);4育齡三角帆蚌的吞噬率最高,達(dá)到37.5%,但3、4、5育齡三角帆蚌的吞噬率差異不明顯(P＞0.05)。吞噬指數(shù)也存在同樣的趨勢,2、3育齡三角帆蚌血細(xì)胞的吞噬指數(shù)明顯低于4、5育齡的三角帆蚌(P＜0.05),4育齡三角帆蚌的吞噬指數(shù)最高,達(dá)3.7。這表明低育齡三角帆蚌的吞噬活性比高育齡三角帆蚌要低。

3 討論

3、4育齡的三角帆蚌抗菌活力明顯比2、5育齡的三角帆蚌要高,說明隨著三角帆蚌的生長其抗菌活力越來越強(qiáng),但育齡達(dá)到5齡時(shí)其抗菌活力又有所下降。三角帆蚌免疫能力的變化趨勢與其培育的珍珠質(zhì)量是一致的[9]。

本研究表明:三角帆蚌血漿對(duì)革蘭氏陽性菌的抗菌活力明顯高于對(duì)革蘭氏陰性菌。類似的結(jié)果在對(duì)櫛孔扇貝Chlamys farreri的研究中也有發(fā)現(xiàn),即櫛孔扇貝的血清能夠抑制金黃色葡萄球菌、四聯(lián)微球菌Micrococcus tetragenus、枯草桿菌Bacillus subti lis等革蘭氏陽性菌的生長,而不能抑制哈維氏弧

菌Vibrio harveyi、嗜水氣單胞菌等革蘭氏陰性菌的生長[7]。在貝類養(yǎng)殖過程中,貝類經(jīng)常容易感染弧菌、氣單胞菌、假單胞菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌而導(dǎo)致患病,這與貝類血清或血漿中對(duì)這些細(xì)菌的抑菌活性較低有一定關(guān)系。

圖1 不同育齡三角帆蚌血漿的抗菌活力(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)Fig.1 Plasma antibacterial activities in freshwater mussels with different ages(Mean±S.E.)

圖2 不同育齡的三角帆蚌吞噬活性(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)Fig.2 Haemocytes phagocytic activities of freshwater mussels with different ages(Mean±S.E.)

不同育齡的三角帆蚌對(duì)4種細(xì)菌的抗菌百分率為30.4%～56.1%,說明三角帆蚌血漿對(duì)這4種細(xì)菌均存在一定的抑菌效果。但中國對(duì)蝦Penaeus chinensis的血淋巴與溶藻膠弧菌Vibrio alginolyticus、哈維氏弧菌、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、嗜水氣單胞菌等菌懸液在孵育1～4 h后,均能抑制這些細(xì)菌的生長,但細(xì)菌生長卻呈現(xiàn)兩種不同的趨勢。1～4 h內(nèi)隨著孵育時(shí)間的延長,溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌的生長菌落數(shù)量越來越多,而嗜水氣單胞菌的生長菌落數(shù)量越來越少[10]。這種現(xiàn)象在對(duì)櫛孔扇貝和牡蠣Crassostrea virginica的研究中也出現(xiàn)過,即櫛孔扇貝和牡蠣的血清不但不能直接抑制或殺死細(xì)菌和真菌,反而為細(xì)菌的生長提供營養(yǎng),從而造成細(xì)菌生長的菌落數(shù)比對(duì)照組還要高,殺滅和清除細(xì)菌最終還要依賴于機(jī)體的其它免疫作用,如吞噬和溶解[7,11]。

血細(xì)胞的吞噬活性是機(jī)體免疫防御的重要功能[12],很多因素均能影響吞噬活性。本研究中低育齡三角帆蚌吞噬活性低于高育齡的三角帆蚌,這與Dikkeboom等[13]的研究結(jié)果基本一致,即4～5月齡靜水椎實(shí)螺Lymnaea stagnalis的吞噬活性明顯低于12～13月齡。但在櫛孔扇貝和紫貽貝Mytilus galloprovincialis中卻均發(fā)現(xiàn)4月齡貝和9月齡貝其

吞噬活性差異不明顯[5,14]。這說明同種貝中只有月齡或年齡差異比較大時(shí)吞噬活性才有顯著差異。外界環(huán)境條件如溫度也是影響貝類吞噬活性的另一主要因素。在一定溫度范圍內(nèi)吞噬率與溫度呈正相關(guān)[8],但當(dāng)溫度超過臨界范圍,如高溫將會(huì)抑制血細(xì)胞的吞噬活性[4,15];相對(duì)于低溫來說,高溫對(duì)貝類吞噬活性的影響更大[14]。除了溫度以外,鹽度、受細(xì)菌感染程度也影響貝類的吞噬活性[8,14]。此外,水環(huán)境中的金屬離子也能影響貝類的吞噬活性,如Cu2+、Ca2+、Mg2+和EDTA均能抑制背角無齒蚌的吞噬活性[16-17]。

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Comparison of antibacterial activities and phagocytosis in freshwater mussel Hyriopsis cumingii with different pearl-cultivation age

XU Qiao-qing1,HAO Li-ping2
(1.Engineering Research Center of Wetland Agriculture in the Middle Reaches of the Yangtze River,Ministry of Education,Yangtze University, Jingzhou 434025,China;2.Hubei Information Engineering School,Jingmen 448124,China)

Plasma antibacterial activities to Staphyloccocus aureus,Micrococcus lysodeikticus,Aeromonas hydrophilia,and Escherichia coli and haemocyte phagocytosis to Staphyloccocus aureus were studied in freshwater mussel Hyriopsis cumingii with different ages.The result showed that there were higher antibacterial activities to Gram-positive bacilli(Micrococcus lysodeikticus and Staphylococcus aureus)than those to two Gram-negative bacilli(Escherichia coli and Aeromonas hydrophilia)in the 2-5 age mussels,the maximal antibacterial activity in 3-age mussel. The maximal haemocytes phagocytosis to Staphyloccocus aureus was observed in the 4-age mussels with the phagocytic rate of 36.6%and phagocytic index of 3.75 and the minimal in 2-age mussels with the phagocytic rate of 25. 2%and phagocytic index of 2.95.Those were attributed to the highest antibacterial activities and phagocytosis in 3 -4 age mussel and the highest capacity against external pathogens.However,the immune capacity was found to be declined with the increase in period of the pearl cultivation.

Hyriopsis cumingii;antibacterial activity;phagocytosis

Q959.215

A

2095-1388(2011)05-0442-04

2010-12-16

湖北省科技計(jì)劃自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(ZRY2010)

許巧情(1976-),女,副教授。E-mail:xuqiaoqing@163.com