劉彥威,王斌,劉娜,劉利強(qiáng),林燕

(河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院,河北邯鄲056021)

新城疫(Newcastle disease,ND),又稱為亞洲雞瘟,是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種高度接觸性傳染病,本病自1926年首次發(fā)生以來(lái),已成危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的最嚴(yán)重的禽病之一。盡管對(duì)該病在診斷與防制方面進(jìn)行了大量的研究,并取得了較大的成就,但目前尚無(wú)有效的治療方法[1-2]。

冬蟲夏草是一種名貴的中草藥材,含有多種藥理活性成份,比如核苷、多糖、甘露糖等。冬蟲夏草具有多種生物活性：抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤,抗菌,調(diào)節(jié)血脂等[3-4]。目前,冬蟲夏草的抗病毒活性報(bào)道較少。Ohta等[5]從北冬蟲夏草中分離出一種酸性多糖,發(fā)現(xiàn)該多糖可以降低甲型流感病毒(influenzaAvirus)感染小鼠肺泡灌洗液中流感病毒滴度,升高血清中TNF-alpha和IFN-gamm等細(xì)胞因子的水平,具有較強(qiáng)的抗流感病毒的活性。最近,實(shí)驗(yàn)證明冬蟲夏草提取物具有抗人巨細(xì)胞病毒活性和抗甲型流感病毒的活性[6]。鑒于此,本課題擬研究冬蟲夏草是否具有抗雞NDV活性。由于野生冬蟲夏草的昂貴,本研究選用市面上可以買到的人工冬蟲夏草菌絲體為研究對(duì)象,采用低溫下水浸提的方法,獲取冬蟲夏草菌絲體粗提物,檢測(cè)其抗雞NDV活性。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

DMEM培養(yǎng)基(Gibco);MTT(Sigma);Vero細(xì)胞和新城疫病毒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病室惠贈(zèng)。酶標(biāo)儀(MB-IV)：北京艾普生物設(shè)備有限公司, CO2培養(yǎng)箱(BC-J80S)：上海搏迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠,倒置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 冬蟲夏草菌絲體水提物的配制

(1)在超凈工作臺(tái)中,取干燥菌絲體,放高速組織搗碎機(jī),加入100mL水。溫度控制在4℃,置搖床上浸提105rpm,每次浸提24h,8 000rpm離心留取上清,共浸提3次,每次均加入100mL水,合并上清后,250mL試劑瓶分裝。

(2)放入-40℃冰箱,冷凍,真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥。得到浸膏后放-40℃冰箱保存,備用。

(3)取凍干菌絲體水提物,加入水,混勻,溶解后,用0.22μ m微孔濾膜過(guò)濾,放4℃冰箱備用,用細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM)稀釋成使用液。

1.2.2 MTT檢測(cè)

(1)待培養(yǎng)的Vero細(xì)胞鋪滿后,吸掉培養(yǎng)液上清,清洗兩次,加入配制好的0.05%胰酶消化貼壁細(xì)胞,待細(xì)胞變圓脫落后,加入含10%FBS的培養(yǎng)液終止反應(yīng)。

(2)將細(xì)胞吹勻后,計(jì)數(shù),轉(zhuǎn)入96孔板(104細(xì)胞/孔),其中第1列與第12列,加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)液,放入CO2培養(yǎng)箱,37℃,5%CO2培養(yǎng)。

(3)24h后,觀察細(xì)胞,如呈較好分布,則加入等量梯度稀釋藥物,其中第11列不加藥物,作為對(duì)照。

(4)72h后,每孔分別加入含5mg/ml MTT的培養(yǎng)液30μ l,孵育6h。

(5)吸干上清后,加入DMSO 150μ l,在振蕩器上混勻5min。

(6)用酶標(biāo)儀讀板,記錄OD570nm值。

1.2.3 病毒液TCID50(半數(shù)感染量)的測(cè)定

吸取已培養(yǎng)好Vero細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板(Costar)的培養(yǎng)液,將新城疫病毒(F48株)用維持液分別配成原液的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10懸液10管,接種在Vero細(xì)胞板中1h,吸棄病毒懸液,加維持液,每濃度梯度重復(fù)6孔,設(shè)空白對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。放于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),72h后觀察結(jié)果。CPE法判斷細(xì)胞病變程度見(jiàn)表1。按Reed-Muench公式計(jì)算TCID50。新城疫病毒的TCID50為10-5。

表1 細(xì)胞病變程度判定標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Standards for determining of cytopathic effect

1.2.4 水提物對(duì)新城疫病毒的直接作用

將TCID50(10-5)、10TCID50(10-4)、100TCID50(10-3)的新城疫病毒懸液分別與水提物混合,37℃水浴1h,加入培養(yǎng)Vero細(xì)胞的96孔細(xì)胞板中作用1h,吸棄液體,加維持液,每組重復(fù)6孔,并設(shè)無(wú)毒濃度藥品對(duì)照(僅加水提物)、細(xì)胞對(duì)照(病毒和水提物均不加)、病毒對(duì)照(僅接種病毒)。放于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),72h用CPE法觀察結(jié)果。

1.2.5 水提物對(duì)新城疫病毒的預(yù)防作用

將培養(yǎng)好Vero細(xì)胞的96孔板中的液體吸出,加入水提物 100μ L37℃作用1h,吸棄液體,加TCID50、10TCID50、100TCID50的新城疫病毒懸液100μ L 37℃作用1h,吸棄液體,并設(shè)無(wú)毒濃度藥品對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照。放于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中作用48h,用CPE法觀察結(jié)果。

1.2.6 水提物對(duì)新城疫病毒的治療作用

將培養(yǎng)Vero細(xì)胞的96孔板中的液體吸出,加TCID50、10TCID50、100TCID50的新城疫病毒懸液100μ L37℃作用1h,吸棄液體,加入水提物100μ L 37℃作用1h,吸棄液體,并設(shè)無(wú)毒濃度藥品對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照。放于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中作用48h,用CPE法觀察結(jié)果。所得結(jié)果進(jìn)行秩和檢驗(yàn)中的Ridit檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 浸膏的特征

菌絲體經(jīng)過(guò)粉碎、浸提、真空冷凍干燥后,形成浸膏,為褐色,較粘稠,但用水很容易將其融解,得到褐色的儲(chǔ)備液(100mg/mL),最后用培養(yǎng)液稀釋。

2.2 水提物的濃度與毒性

在選擇冬蟲夏草水提物的測(cè)試濃度時(shí),當(dāng)冬蟲夏草水提物濃度為1mg/mL時(shí),對(duì)細(xì)胞具有代謝毒性,而為0.1mg/mL時(shí),無(wú)代謝毒性。所以我們選擇2mg/mL,進(jìn)行4倍系列稀釋,這樣可以保證有產(chǎn)生細(xì)胞毒性的濃度,也可保證較小的組間差別,而且梯度差別較大,OD值上可以表現(xiàn)出一定的差距。

當(dāng)冬蟲夏草水提物濃度為2mg/mL時(shí),在鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞邊界清晰,但是有些細(xì)胞已經(jīng)懸浮,細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重改變,胞質(zhì)中有異物感,細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的細(xì)胞病變。而在0.5mg/mL的濃度下。與未添加藥物的細(xì)胞相比,鏡下觀察,沒(méi)有變化。同時(shí)采用 MTT法,當(dāng)冬蟲夏草水提物濃度≤0.5mg/ml,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的活性基本沒(méi)有變化(表2)。

表2 菌絲體水提物的細(xì)胞毒性試驗(yàn)Tab.2 Cytotoxicity assay of water extract from mycelium of Cordyceps sinensis

2.3 對(duì)病毒的作用

(1)直接殺滅作用。水提物在100TCID50病毒(10-3)時(shí),對(duì)病毒抑殺作用不明顯(表3),在10TCID50病毒(病毒量為10-4)時(shí),明顯抑制Vero細(xì)胞CPE形成,與病毒對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P＜0.05),在1TCID50病毒(毒量為10-5)時(shí),基本可抑制Vero細(xì)胞CPE形成。病毒對(duì)照有明顯的細(xì)胞病變出現(xiàn),而藥物對(duì)照未見(jiàn)細(xì)胞病變,提示藥物對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。細(xì)胞對(duì)照也未出現(xiàn)病變。

表3 水提物抗病毒的直接殺滅作用Tab.3 Direct antivirus effect of Bran lectin on virus infection

(2)預(yù)防作用。水提物在 100TCID50病毒(10-3)和10TCID50病毒(10-4)時(shí),對(duì)病毒抑殺作用不明顯(表4),在1TCID50病毒(10-5)時(shí),明顯抑制Vero細(xì)胞CPE形成,與病毒對(duì)照組統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P＜0.05)。病毒對(duì)照有明顯的細(xì)胞病變出現(xiàn),而藥物對(duì)照未見(jiàn)細(xì)胞病變,提示藥物對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。細(xì)胞對(duì)照也未出現(xiàn)病變。

表4 水提物對(duì)病毒的預(yù)防作用Tab.4 Preventive effect of Bran lectin on virus infection

(3)治療作用。水提物對(duì)不同濃度的病毒均沒(méi)有治療作用(表5)。病毒對(duì)照有明顯的細(xì)胞病變出現(xiàn),而藥物對(duì)照未見(jiàn)細(xì)胞病變,提示藥物對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。細(xì)胞對(duì)照也未出現(xiàn)病變。

表5 水提物對(duì)病毒的治療作用Tab.5 Therapeutic effect of Bran lectin on virus infection

3 結(jié)論

1)大體積溶劑低溫浸提,可以充分溶解成份,從而減小了低溫下某些成份溶解速度慢,溶解度低的弊端。

2)0.5mg/ml冬蟲夏草水提物對(duì)細(xì)胞的代謝無(wú)影響。

3)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水提物對(duì)病毒具有預(yù)防和抑殺作用,而對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性,是一種低毒的體外抗新城疫病毒物質(zhì),具有潛在的抗雞新城疫病毒臨床應(yīng)用價(jià)值。

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