馬悅欣,王穎,楊鳳,閆喜武,霍忠明

(大連海洋大學農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學重點開放實驗室,遼寧大連116023)

應用PCR-DGGE技術研究四角蛤蜊的細菌多樣性

馬悅欣,王穎,楊鳳,閆喜武,霍忠明

(大連海洋大學農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學重點開放實驗室,遼寧大連116023)

應用PCR-DGGE技術對盤錦某灘涂四角蛤蜊Mactra venerformis體內(nèi)的細菌多樣性進行了分析。使用SDS裂解法提取樣品的總DNA,采用大多數(shù)細菌通用引物F338GC/R518從總DNA中成功擴增出16S rDNA片段,然后對PCR產(chǎn)物進行DGGE分析,并將DGGE圖譜上部分條帶回收、再擴增、克隆和測序;將所測序列在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進行檢索,用BLASTN分析DNA序列獲得相似性最近的細菌。DGGE圖譜顯示,四角蛤蜊體內(nèi)的細菌種類比較豐富,且不同時間樣品細菌的優(yōu)勢菌群結(jié)構有一定的差異。將所測條帶序列進行比對,結(jié)果表明,細菌種群中包括支原體屬Mycoplasma、假單胞菌屬Pseudomonas、弧菌屬Vibrio、紅球菌屬Rhodococcus和鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas及不可培養(yǎng)的細菌。

四角蛤蜊;PCR-DGGE;細菌多樣性

四角蛤蜊Mactra venerformis肉質(zhì)細嫩、味道鮮美,是中國頗具養(yǎng)殖前途的灘涂貝類。四角蛤蜊營埋棲生活,生活在潮間帶的中、低潮區(qū)及淺海的泥砂灘。一般情況下,四角蛤蜊體內(nèi)存在著維持微生態(tài)平衡的正常菌群,但在其抗病力低下或環(huán)境不利時,此類細菌可大量繁殖,引起感染。因此,了解四角蛤蜊體內(nèi)正常細菌的菌群組成,對其健康養(yǎng)殖是很重要的。有關貝類體內(nèi)細菌種群組成的調(diào)查已有一些報道[1-3],研究中使用的是傳統(tǒng)微生物學方法。近年來,PCR-DGGE技術已被廣泛地應用到微生物多樣性研究中。Hovda等[4]、劉淮德等[5]和Amaro等[6]使用PCR-DGGE技術分別研究了大西洋鮭Salmo salar、南美白對蝦Penaeus vannamei和海參Portuguese canyons腸道中細菌的多樣性。本試驗中,作者采用PCR-DGGE技術對四角蛤蜊體內(nèi)的細菌多樣性進行了研究,旨在為促進該貝類的健康養(yǎng)殖提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

于2009年6月2日、8月30日、11月20日和2010年3月30日、5月4日從盤錦某灘涂取四角蛤蜊,置于加冰的保溫箱中運回實驗室,用體積分數(shù)為70%的乙醇對四角蛤蜊進行體表消毒,用無菌刀開啟,取出肌肉和內(nèi)臟,置于研缽中研碎,取適量放入Eppendorf管中,于-20℃下保存。

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取和PCR擴增 于Eppendorf管樣品中加入567 μL DNA提取液(包括100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L EDTA、100 mmol/L磷酸鈉、1.5 mol/L NaCl、10 g/L的CTAB、pH為8.0)和3 μL蛋白酶K,于37℃下水浴30 min;加入30 μL 10 g/L的SDS,充分混勻,于65℃下水浴2 h,期間不斷混勻,取出后置于室溫下離心10 min(12 000 r/min);取上清液置于另一個1.5 mL的離心管中,加入等體積的Tris-飽和酚抽提,以12 000 r/min于4℃下離心10 min;取上清液,用混合液[φ(酚)∶φ(氯仿)∶φ(異戊醇)= 25∶24∶1和φ(氯仿)∶φ(異戊醇)=24∶1]各抽提一次,于4℃下離心10 min(12 000 r/min);取上清液,加入0.6倍體積的異丙醇于室溫下沉淀20 min,于4℃下以12 000 r/min離心20 min;去

上清液,用體積分數(shù)為70%的乙醇洗滌沉淀,于室溫下干燥30 min后溶于30 μL無菌TE緩沖液中,加入3 μL RNA酶,于37℃下水浴30 min,取出后置于-20℃下保存。以提取的總DNA為模板,用引物F338GC(5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')與R518(5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')擴增四角蛤蜊細菌DNA的16S rDNA片段。50 μL反應體系中含5 μL 10×PCR Buffer,4μL dNTPs,各2μL(20 mmol/L)引物,2.5 U Taq酶,2 μL DNA模板, 34 μL ddH2O。反應程序為:94℃下預變性5 min; 94℃下變性1 min,65℃下復性1 min(每個循環(huán)降低0.5℃),72℃下延伸1 min,共進行24個循環(huán);94℃下變性1 min,53℃下復性1 min,72℃下延伸1 min,共進行11個循環(huán);最后于72℃下延伸10 min。用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小。

1.2.2 DGGE分析 采用Bio-Rad公司D-code通用突變檢測系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進行DGGE分析。將PCR反應產(chǎn)物直接上樣于含質(zhì)量分數(shù)為35%～60%的梯度變性劑的80 g/L的聚丙烯酰胺凝膠中。在TAE中電泳5 h(溫度為60℃,電壓為200 V),采用銀染方法染色核酸,用凝膠成像儀觀察。

1.2.3 DGGE條帶的克隆和測序 切下DGGE條帶溶于50 μL無菌水中,4℃過夜,取2 μL作為模板,用引物F338/518R進行PCR擴增,反應體系和反應程序同“1.2.1”。PCR用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測,并切膠純化。純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化到E.coli DH5a感受態(tài)細胞中,在含有X-gal、IPTG和Amp的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)16 h(37℃);將藍白斑篩選陽性轉(zhuǎn)化子接種于LB培養(yǎng)基中,37℃下振蕩過夜,以培養(yǎng)的菌液為模板,用引物RV-M/MB-47進行PCR反應檢測陽性克隆,將陽性克隆產(chǎn)物送天根公司進行測序。將所測DNA序列在GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中進行檢索,從BLAST比對結(jié)果中取相似性最近的序列。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA的提取和PCR擴增

提取的總DNA經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果見圖1。從圖1可見,四角蛤蜊樣品DNA條帶較亮,無拖帶現(xiàn)象。

圖1 對不同樣品中提取的DNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from the samples collected at different time

使用通用引物F338GC/R518對總DNA進行PCR擴增,用10 g/L的瓊脂糖對擴增產(chǎn)物進行電泳,結(jié)果見圖2。通過與Marker對比,可知目標片段長度約為230 bp。該條帶較亮,無拖帶現(xiàn)象,說明PCR擴增效果良好。

圖2 對不同樣品的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products from the samples collected at different time

2.2 DGGE分析

對不同時間采集的四角蛤蜊樣品進行DGGE分析,結(jié)果見圖3。從圖3可見,四角蛤蜊體內(nèi)具有比較豐富的細菌菌群組成,不同時間采集的樣品

中細菌的優(yōu)勢菌群組成明顯不同。比較而言,2009年6月采集的樣品中細菌多樣性較高,有13條帶; 2009年8月、2010年3月30日和5月采集的樣品中各有9條帶,2009年11月采集的樣品中細菌多樣性稍低,只有8條帶。

圖3 對不同月份采集的樣品的DGGE凝膠電泳圖Fig.3 DGGE profile of the samples collected at different time

DGGE部分條帶序列的BLAST分析結(jié)果見表1。條帶A1(或E2)和條帶A3分別與Mycoplasma pulmonis PG34(T)[7]和不可培養(yǎng)的Mycoplasma sp.clone ME97的相似性為90%和95%。條帶A4與不可培養(yǎng)的Pseudomonas sp.clone JAB_PL01F_ E02的相似性為100%。Schulze等[8]從野生的大文蛤Panopea abrupta、成體扇貝Patinopecten yessoensis和牡蠣Crassostrea gigas體內(nèi)分離出與假單胞菌屬Pseudomonas spp.同源性達98%～99%的菌株,而假單胞菌屬Pseudomonas是黑蛤Villorita cyprinoides var.cochinensis體內(nèi)正常的細菌區(qū)系組成[3]。條帶A6與Vibrio tasmaniensis UDC391(V.cyclitrophicus strain Col 15和Vibrio splendidus strain GHrC15)的相似性為100%,而弧菌屬是黑蛤體內(nèi)的優(yōu)勢種群[3]。V.cyclitrophicus和V.splendidus是Galicia養(yǎng)殖蛤體內(nèi)的優(yōu)勢弧菌[9]。Schulze等[8]從野生的大文蛤、成體扇貝和幼雜色鮑Haliotis kamtschatkana體內(nèi)分離出與Vibrio tasmaniensis同源性達99%的菌株。條帶A7與Rhodococcus sp.的相似性為99%。紅球菌屬具有廣泛的底物作用譜,在生物降解、生物修復、生物轉(zhuǎn)化和生物表面活性劑等領域得到了越來越普遍的應用[10]。條帶E1和條帶E3與Sphingomonas sp.30D12和Sphingomonas sp.V1-2的相似性分別為99%和100%,后者是從Kongsfjorden的海洋沉積物中獲得的[11]。Sphingomonas是一類豐富的新型微生物資源,可用于芳香化合物的生物降解,該屬菌株憑借自身的高代謝能力與多功能的生理特性,在環(huán)境保護及工業(yè)生產(chǎn)方面具有巨大的應用潛力[12]。

表1 DGGE條帶序列的BLAST結(jié)果Tab.1 The BLAST analysis of the sequences of DGGE bands

3 結(jié)論

本研究中,作者采用PCR-DGGE技術分析了四角蛤蜊體內(nèi)的細菌多樣性。DGGE圖譜顯示,四角蛤蜊體內(nèi)的細菌菌群較豐富,不同時間采集的樣品中優(yōu)勢菌群的組成明顯不同,6月份采集的四角

蛤蜊體內(nèi)的細菌多樣性較高,11月份采集的四角蛤蜊體內(nèi)的細菌多樣性稍低。部分DGGE條帶序列比對的結(jié)果表明,四角蛤蜊體內(nèi)含有支原體屬Mycoplasma、假單胞菌屬Pseudomonas、弧菌屬Vibrio、紅球菌屬Rhodococcus、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas和不可培養(yǎng)的細菌。

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The analysis of bacterial diversity in clam Mactra venerformis by PCR-DGGE

MA Yue-xin,WANG Ying,YANG Feng,YAN Xi-wu,HUO Zhong-ming
(Key Laboratory of Mariculture,Agriculture Ministry,PRC,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

In this study,the bacterial diversity was studied in clam Mactra venerformis collected from Panjin sea beach,Liaoning province.The genomic DNA was extracted from the calm using SDS schizolysis method.PCR amplification of the extracted bacterial 16S rDNA fragments was performed using primers F338GC and R518,and then PCR products were analyzed by DGGE.Some clear bands of 16S rDNA fragment from DGGE profiles of the samples were further recoveried,amplified,cloned and sequenced.The closest macth was observed by aligning sequences to be sequenced in the database using BLASTN program.The DGGE profiles revealed that there were abundant bacterial species in the clam samples,and various bands in the samples collected at different time.The band sequence alignment showed that bacterial populations in the clam samples included Mycoplasma,Pseudomonas,Vibrio,Rhodococcus,Sphingomonas and uncultured bacteria.

Mactra venerformis;PCR-DGGE;bacterial diversity

2095-1388(2011)03-0243-04

Q938.1

A

2010-08-18

國家“十一五”科技支撐項目(2006BAD09A09)

馬悅欣(1963-),女,教授。E-mail:mayuexin@dlou.edu.cn