吳皓瓊， 牛彥波， 曹亞彬， 郭立姝， 殷 博

（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010）

目前對(duì)畜禽糞便的處理主要包括物理法、化學(xué)法和生物法三大類。生物發(fā)酵處理法是近年來國內(nèi)外研究較多的一種方法。該法具有成本低、發(fā)酵產(chǎn)物生物活性強(qiáng)、肥效高、易于推廣等特點(diǎn)，同時(shí)可達(dá)到除臭、滅菌的目的，因而被認(rèn)為是最有前途的一種畜禽糞便處理方法。在固體發(fā)酵畜禽糞便過程中，由于廢棄物中含有大量纖維素，因此，加強(qiáng)纖維轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)便成為發(fā)酵充分腐熟的關(guān)鍵。微生物是產(chǎn)生纖維素酶的主要來源，在發(fā)酵的過程中發(fā)揮了巨大的作用。細(xì)菌、放線菌和霉菌都能夠產(chǎn)生纖維素分解酶，常作為接種劑加速糞肥等物料細(xì)胞壁和木質(zhì)素、纖維素水解，促進(jìn)腐殖化過程。其中分解纖維素的真菌主要有曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)和鐮刀菌屬(Fusarium)的一些種。在發(fā)酵過程中，真菌對(duì)發(fā)酵物料的分解和穩(wěn)定起著重要作用[1－5]。本研究從采集的畜禽糞便和土樣中,對(duì)纖維素分解菌進(jìn)行了篩選,同時(shí)對(duì)篩選出的纖維素分解菌與解磷巨大芽孢桿菌、細(xì)黃鏈霉菌等組合形成復(fù)合菌劑（另文發(fā)表）在糞便堆積發(fā)酵中最佳生長(zhǎng)條件進(jìn)行研究，旨在篩選出具有高酶活的纖維素分解菌并形成高效復(fù)合菌劑，加快纖維素的降解，提高糞肥堆積發(fā)酵速度與質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

省內(nèi)采集的畜禽糞便和土樣共計(jì)7個(gè)，用于纖維素分解菌的篩選。發(fā)酵試驗(yàn)用牛糞取自黑龍江省發(fā)酵工程技術(shù)中心。經(jīng)成分分析：牛糞全氮含量為1.18﹪，全磷含量為0.48%，有機(jī)質(zhì)（干基）38.5%，水分75.7%。復(fù)合菌劑由篩選出的纖維素分解菌和解磷巨大芽孢桿菌、細(xì)黃鏈霉菌等復(fù)合形成，本所生產(chǎn)。

1.2 培養(yǎng)基

羧甲基纖維素培養(yǎng)基：CMC-Na 15g，NH4NO31.0g,酵母膏1.0g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO4·3H2O 1.0g，H2O 1000mL，pH自然，瓊脂15g,121℃、30min蒸汽滅菌。

赫奇遜培養(yǎng)基：KH2PO4·3H2O 1.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl20.1g，NaCl 0.1g，F(xiàn)eCl30.01g，NaNO32.5g，H2O 1000 mL，pH 7.0,121℃、30min蒸汽滅菌。

纖維素剛果紅培養(yǎng)基：KH2PO4·3H2O 0.5g,MgSO4· 7H2O 0.25g,微晶纖維素1.88g，明膠2g，剛果紅0.2g，土壤浸出液100 mL，H2O 900 mL，瓊脂15g，pH 6.5，121℃、30min蒸汽滅菌。

纖維素瓊脂培養(yǎng)基：（NH4）2NO32g，MgSO4·7H2O 1.0g，CaCO32g，NaCl 1.0g，H2O 1000 mL，瓊脂15g，pH 7.0，121℃、30min蒸汽滅菌。

純化培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯汁20%,蔗糖20g,瓊脂15g,水1000 mL，121℃、30min蒸汽滅菌。

固體曲培養(yǎng)基：無霉變米糠粉、麩皮（過60目篩），加適量無菌水，調(diào)節(jié)水分至50%左右，pH自然，121℃、60min蒸汽滅菌。

察氏培養(yǎng)基：蔗糖3.0g，NaNO33.0g，MgSO4· 7H2O 0.5g，KCl 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，K2HPO41.0g，瓊脂15.0g，H2O1000 ml，pH自然。

1.3 方法

1.3.1 纖維素分解菌的分離與純化（初篩）

將樣品采用“彈土法”點(diǎn)接于羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上,置28℃培養(yǎng),挑選出在平板上生長(zhǎng)快、透明圈大的培養(yǎng)物；將樣品稀釋到適宜程度（一般情況下10－1～10－3）,吸取1mL稀釋液,用纖維素剛果紅培養(yǎng)基制成混菌平板,置28℃培養(yǎng),挑選出在平板上生長(zhǎng)快、紅色濃郁且水解圈大的培養(yǎng)物；將樣品接種于內(nèi)放濾紙條的赫奇遜培養(yǎng)液中,置28℃培養(yǎng)5～7d,挑選出將濾紙條分解斷裂快的培養(yǎng)物。

將挑選出的以上培養(yǎng)物在PDA培養(yǎng)基上多次劃線和用稀釋平板法篩選出單個(gè)菌落,結(jié)合鏡檢,反復(fù)多次,直至純化為單菌株。

1.3.2 不同菌株對(duì)濾紙分解能力的測(cè)定（復(fù)篩）

采用濾紙失重率法：將選出的菌株單株或混合株分別接種于以濾紙為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基中，28℃、120r/min搖床培養(yǎng)，觀察濾紙的崩解效果,以“+”的多少來表示濾紙崩解程度,“+”越多,說明該菌株的降解效果越強(qiáng)。

用濾紙過濾發(fā)酵液，將殘留物80℃烘干稱重，用減重法計(jì)算出濾紙失重率。

計(jì)算公式：濾紙失重率S（%）＝（A－B）／A× 100%

其中：A-初始濾紙重，gB-殘留濾紙重，g。1.3.3不同菌株對(duì)羧甲基纖維素分解能力的測(cè)定（復(fù)篩）

將分離的單個(gè)菌株及其混合菌分別點(diǎn)種于羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上,28℃培養(yǎng)3d,測(cè)透明圈直徑。并計(jì)算酶相對(duì)活性：

式中:A為相對(duì)活性；d為透明圈直徑；t為培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.4 纖維素酶的測(cè)定

1.3.4.1 接種與培養(yǎng)

將固體曲培養(yǎng)料121℃、60min蒸汽滅菌，冷卻至35℃左右,搶溫接種待測(cè)菌株懸液。置30℃靜止培養(yǎng),每24h取樣測(cè)纖維素酶活。

1.3.4.2 粗酶液的制備

稱2.0g發(fā)酵曲,加蒸餾水20 mL，30℃水浴1h，每15min搖勻一次，3000r/min離心5min，取上清液為粗酶液。

1.3.4.3 纖維素酶活的檢測(cè)

用3,5二硝基水楊酸(DNS)比色法，測(cè)定還原糖含量來確定FPA、CMC、C1三種纖維素酶活。

FPA濾紙酶活的測(cè)定：緩沖液2.0 mL,加入1× 6cm新華濾紙一張,50℃預(yù)熱5min后加入0.5 mL酶液,50℃保溫1h,取出加2.5 mLDNS試劑,煮沸5min,冷卻后加水5 mL,540nm處測(cè)定還原糖。

CMC酶活的測(cè)定（內(nèi)切葡聚糖酶）：2.0 mL含5% CMC的緩沖液,50℃預(yù)熱5min后加0.5 mL酶液,其余操作同F(xiàn)PA酶活的測(cè)定。

C1酶活測(cè)定：2.0 mL緩沖液中加入50mg脫脂棉,50℃預(yù)熱5min后加入0.5 mL酶液,50℃保溫24h,其余操作同F(xiàn)PA酶活的測(cè)定。

酶活單位U:采用國際制單位,即在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)單位。酶活力即扣除參比溶液中還原糖后,每毫升酶液中所含酶活單位的量。

1.3.5 菌株鑒定

參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》、《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定。

1.3.6 復(fù)合菌劑在糞便堆積發(fā)酵中最佳生長(zhǎng)條件的研究

以牛糞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室模擬條件下，將牛糞自然風(fēng)干至含水量50%以下，去除大塊雜質(zhì)，磨碎待用，按L9(34)正交設(shè)計(jì)各因素水平用稻殼粉、2%麥飯石粉、水等調(diào)節(jié)物料的C/N比以及水分、pH值后，高溫滅菌，置于中號(hào)醫(yī)用搪瓷盤中，上覆塑料薄膜保水，28℃±1℃培養(yǎng)，培養(yǎng)2d后，進(jìn)行翻堆，4d測(cè)定活菌數(shù)。每處理3次重復(fù)，均等取樣混合測(cè)定各數(shù)值?；罹鷶?shù)的測(cè)定參見農(nóng)業(yè)部微生物肥料標(biāo)準(zhǔn)NY884-2005進(jìn)行。正交設(shè)計(jì)各因素水平見表1。

表1 復(fù)合菌劑在堆積發(fā)酵中最佳生長(zhǎng)條件 L9(34)正交設(shè)計(jì)Table 1 L9(34)optimal growth conditions ofcomplexbacteriumin the compostingfermentation

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌菌種篩選及對(duì)濾紙、羧甲基纖維素分解能力的分析

對(duì)7種樣品進(jìn)行系統(tǒng)分離，初篩獲得約20株菌，通過對(duì)菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度的觀察以及分解纖維素能力判定，挑選其中3株用PDA培養(yǎng)基平板進(jìn)行分離純化得到單個(gè)菌株B1、F1、F2。單個(gè)菌株B1、F1、F2以及它們相互混合對(duì)濾紙、羧甲基纖維素分解能力見表2、表3。從表2、表3可以看出：各菌株單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)濾紙、羧甲基纖維素均有一定的分解效果,但不如混合的效果好,B1、F1、F2混合培養(yǎng)8d時(shí)，濾紙失重率達(dá)到58.06%、酶相對(duì)活性0.93±0.00 cm·d-1，由此說明，3株菌株混合可以增加酶活力，各菌之間有很好的協(xié)同效應(yīng)。

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間的濾紙失重率/%Table 2 Weight loss offilter paper in different culture time

表3 不同菌株的纖維素酶相對(duì)活性及對(duì)濾紙的分解效果Table 3 The relative activityofcellulose and the decomposition effect of filter paper on different strains

2.2 纖維素分解菌酶活分析

結(jié)果見表4。從表4可見：B1、F1、F2菌株在固體曲中,都能很好地生長(zhǎng),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),酶活力提高，在培養(yǎng)5～6d時(shí),酶活力達(dá)到最高。各菌株的FPA酶活力是B1F1F2＞B1＞F1＞F2；CMC酶是F1＞B1F1F2＞B1＞F2；C1酶是B1＞B1F1F2＞F1＞F2。各菌混合后FPA酶活力顯著增加，與各菌對(duì)濾紙、羧甲基纖維素分解能力的試驗(yàn)結(jié)果相吻合，進(jìn)一步了證明菌種間的協(xié)同增效作用?；诿富盍Υ笮〉谋容^及生產(chǎn)成本的考慮，選擇B1、F1菌作為堆肥發(fā)酵的試驗(yàn)生產(chǎn)菌。

表4 不同菌株固體曲的纖維素酶活分析 單位:U/mlTable 4 The cellulose activityofthe solid curve ofdifferent strains

2.3 菌株的鑒定

B1、F1菌株生長(zhǎng)迅速，在察氏培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7d，直徑7～8cm，菌絲初期為白色，后期呈綠色，產(chǎn)孢叢束區(qū)擺列成同心輪紋，培養(yǎng)基背面成無色，培養(yǎng)基顏色不改變。分生孢子從菌絲的側(cè)枝上生出，直立，分枝，小枝對(duì)生，頂端不膨大，上生分生孢子團(tuán)，分生孢子球形，淺色或無色。F2菌株生長(zhǎng)迅速，在察氏培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7d，直徑7～8cm，菌絲初期為白色，后期呈青綠色，培養(yǎng)基背面呈無色，培養(yǎng)基顏色不改變。營養(yǎng)菌絲有隔膜，分生孢子梗從菌絲垂直生出，孢梗頂端不膨大，分枝一次，頂端為小梗，分生孢子串成不分枝的鏈狀，單個(gè)孢子球形，卵圓形，綠色。

根據(jù)各菌株的菌落特征和形態(tài)特征，按真菌分類鑒定手冊(cè)和真菌分類學(xué)進(jìn)行檢索，初步認(rèn)為B1、F1為木霉(Trichoderma),F2為青霉(Penicillium)。

2.4 復(fù)合菌劑在糞便堆積發(fā)酵中最佳生長(zhǎng)條件的研究

以牛糞為研究對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室模擬條件下，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，研究物料水分、C/N、起始pH及接種量對(duì)復(fù)合微生物菌株生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見表5、表6。

表5 沼渣堆積發(fā)酵工藝條件的確定Table 5 Determination ofthe conditions ofcompostingfermentation ofbiogas residues

表6 沼渣堆積發(fā)酵工藝條件正交試驗(yàn)方差分析（完全隨機(jī)模型）Table 6 Orthogonal analysis ofvariance on the conditions ofcomposting fermentation ofbiogas residues(completelyrandommodel)

從表5、表6可以看出,對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響各因素按極差大小主次順序?yàn)?B＞A＞D＞C，表明物料的C/N的比例對(duì)復(fù)合菌劑活菌數(shù)（生長(zhǎng)）影響最大，物料pH影響最小。FB=38.29743＞F0.05=19,達(dá)顯著水平，表明B因素影響顯著，所以對(duì)該因素應(yīng)控制在最優(yōu)水平上,A、D、C因素對(duì)復(fù)合菌劑活菌數(shù)（生長(zhǎng)）對(duì)結(jié)果影響不大。綜合以上分析，得到最佳堆積發(fā)酵工藝條件A2B3C1D2，即物料C/N為35、水分60%、接種量5%、pH=8.0。在此工藝條件下，適合菌劑中的微生物 生 長(zhǎng) 繁 殖 ，活 菌 數(shù) 達(dá) 到 40.12×108cfu/g。

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