肖 昱,唐 勤,孫妍妍,劉 玥,李葆明,,雷光春,吳小平,

(1.南昌大學(xué) 生命科學(xué)研究院,江西 南昌,330031; 2.復(fù)旦大學(xué) 神經(jīng)生物學(xué)研究所,上海200032; 3.北京林業(yè)大學(xué) 自然保護(hù)區(qū)學(xué)院,北京 100083)

谷氨酸、γ-氨基丁酸、多巴胺、乙酰膽堿和 5-羥色胺作為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要神經(jīng)遞質(zhì),在學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知等行為過(guò)程中起重要作用。軟體動(dòng)物盡管沒(méi)有發(fā)達(dá)的中樞神經(jīng)系統(tǒng),但許多研究表明,它們的神經(jīng)系統(tǒng)中存在大量Glu、GABA、DA、Ach和 5-HT能神經(jīng)元,并具有重要功能[1-4]。文獻(xiàn)報(bào)道,Glu在槍烏賊的神經(jīng)細(xì)胞間信號(hào)傳遞中起著重要作用[5]; GABA 在軟體動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)起興奮和抑制雙重作用[3,6]; Ach是軟體動(dòng)物運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元重要的神經(jīng)遞質(zhì),對(duì)雙殼類動(dòng)物纖毛運(yùn)動(dòng)同時(shí)具有興奮和抑制作用[7]; 5-HT廣泛分布于軟體動(dòng)物,如無(wú)齒蚌(Anodonta piscinalis)、褐云瑪瑙螺(Achatina fulica)、紫貽貝(Mytilus edulis)、地中海貽貝(Mytilus galloprovicialis)神經(jīng)系統(tǒng)和其他組織[8-10],可能與感覺(jué)信息傳遞有密切關(guān)系[11]。

褶紋冠蚌(Cristaria plicata(Leach))隸屬瓣鰓綱(Lamellibranchia)、真瓣鰓目(Eulamellibranchiata)、蚌科(Unionidae),是中國(guó)重要的淡水經(jīng)濟(jì)蚌種之一。關(guān)于淡水蚌類神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元類型及分布,迄今知之甚少。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖顷U明淡水蚌神經(jīng)系統(tǒng)Glu、GABA、DA、Ach和5-HT能神經(jīng)元的分布及形態(tài)學(xué)特征,尤其是闡明它們是否存在于同一神經(jīng)元內(nèi),以期為淡水貝類的行為學(xué)和保護(hù)等方面研究等方面提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品

小鼠抗谷氨酸單克隆抗體(ab78944,Abcam公司)、小鼠抗谷氨酸脫羧酶(GAD67)單克隆抗體(ab26116,Abcam公司)、小鼠抗酪氨酸羥化酶單克隆抗體(T1299,Sigma公司)、小鼠抗膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶單克隆抗體(ab78023,Abcam公司)、小鼠抗色氨酸羥化酶單克隆抗體(T0678,Sigma公司)、生物素化羊抗小鼠 IgG (Jackson公司)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素(Jackson公司)、DAB試 劑盒(中山金橋公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

褶紋冠蚌購(gòu)買于上海市徐匯區(qū)萬(wàn)有全集團(tuán)新鮮市菜場(chǎng),選取健壯無(wú)損傷的鮮活個(gè)體。

1.3 H.E.染色

分離臟神經(jīng)節(jié),迅速放入現(xiàn)配預(yù)冷的4%多聚甲醛(0.1 mol/L PB)固定液中,4℃固定6～8 h。取出神經(jīng)節(jié),依次放入10%、20%、30%的 PB-蔗糖溶液中梯度脫水(4℃),直至標(biāo)本沉至容器底部。O.C.T包埋,于冰凍滑動(dòng)切片機(jī)(Leica,Germany; -25℃)冠狀連續(xù)切片,片厚為10 μm。將切片貼于涂有鉻礬明膠的載玻片上。風(fēng)干后,用蘇木素-伊紅(H.E.)染色法染色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,OLYMPUS BX41系統(tǒng)顯微鏡下觀察并拍照記錄結(jié)果。

1.4 免疫組織化學(xué)

采用 SP免疫組織化學(xué)法：-25℃冠狀連續(xù)切片,片厚為40 μm。將切片放入0.01 mol/L PBS(磷酸緩沖液)中充分漂洗后,置入 0.3% H2O2室溫處理 4～5 min(抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶),PBS漂洗 3×10 min;加入 0.5%Triton X-100(PBST(PBS,0.5% Triton X-100)),室溫?fù)u床反應(yīng) 30 min; 棄去 Triton,加入10%正常羊血清室溫孵育30 min(抑制非特異性吸附);棄去血清,滴加 1∶500稀釋的一抗,4℃孵育 72 h,PBS漂洗3×10 min; 滴加1∶500稀釋的二抗(生物素化羊抗小鼠IgG),室溫孵育2 h,PBS漂洗3×10 min;滴加1∶500稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素,室溫反應(yīng) 1 h,PBS漂洗 3×10 min; 滴加DAB-H2O2成色反應(yīng),室溫約 2～3 min至變色適度,放入 0.1 mol/L Tris-HCl終止成色反應(yīng); 0.1 mol/L PBS中將切片貼于涂有鉻礬明膠的載玻片上,風(fēng)干;蘇木素復(fù)染2 min,自來(lái)水藍(lán)化10 min,蒸餾水漂洗10 s,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,鏡檢并拍照記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中,以10%正常羊血清與0.2% Triton X-100等比例混合成的抗體稀釋液代替一抗作為空白對(duì)照,結(jié)果為陰性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

臟神經(jīng)節(jié)是褶紋冠蚌中樞神經(jīng)系統(tǒng)最大的神經(jīng)節(jié),2個(gè)對(duì)稱的臟神經(jīng)節(jié)愈合成1對(duì)蝴蝶狀結(jié)構(gòu),緊貼于后閉殼肌前緣腹側(cè)表面,表面呈淡黃色。其背側(cè)面平滑,腹側(cè)面膨脹突起且表面光滑。前側(cè)逐漸變細(xì)成為腦臟神經(jīng)連索,與腦神經(jīng)節(jié)相連; 后端也逐漸變細(xì)成為 1對(duì)粗大的外套神經(jīng),延伸到身體后端外套膜; 前腹側(cè)方兩側(cè) 1對(duì)弓狀突起,彎向背側(cè)延伸至鰓腔中成為鰓神經(jīng)。

應(yīng)用 H.E染色法,作者標(biāo)記出臟神經(jīng)節(jié)由神經(jīng)節(jié)被膜、胞體區(qū)和中央纖維網(wǎng)區(qū) 3部分組成。胞體區(qū)神經(jīng)元分層不明顯,神經(jīng)細(xì)胞屬單極型,多呈梨形或卵圓形,少數(shù)為不規(guī)則形。根據(jù)胞體直徑大小明顯分為小型(5～15 μm)、中型(15～35 μm)和大型(35～50 μm)細(xì)胞3種類型。細(xì)胞核多為圓形或橢圓形,多居于胞質(zhì)中央,大小為 6～15 μm。不同大小的神經(jīng)元胞體散亂分布在神經(jīng)節(jié)表面,有時(shí)會(huì)大量聚集成簇分布。在中央神經(jīng)纖維網(wǎng)區(qū)有少量神經(jīng)胞體成簇分布,它們大部分為中、小型細(xì)胞。胞體發(fā)出的突起均進(jìn)入中央神經(jīng)纖維網(wǎng),中央神經(jīng)纖維網(wǎng)內(nèi)的神經(jīng)纖維呈散亂絮狀分布(圖1-1,圖1-2)。

2.2 自發(fā)熒光現(xiàn)象

應(yīng)用 OLYMPUS BX-URA2熒光顯微鏡,在450～480 nm和510～550 nm兩種激發(fā)光濾光片帶處,觀察經(jīng)多聚甲醛固定過(guò)的臟神經(jīng)節(jié)冰凍切片。結(jié)果顯示：多數(shù)神經(jīng)元胞體能自發(fā)紅色和綠色熒光,其中紅色熒光強(qiáng)于綠色熒光。這些自發(fā)熒光的胞體遍及神經(jīng)節(jié)的整個(gè)胞體區(qū),且呈不規(guī)則排列。中央神經(jīng)纖維網(wǎng)靠近腦-臟神經(jīng)連索區(qū)域和鰓神經(jīng)區(qū)域亦存在大量具有自發(fā)熒光的纖維神經(jīng),呈念珠狀或少量靜脈曲張狀放射分布(圖2-1,圖2-2,圖2-3,圖2-4,)。在 100×油鏡下,可觀察到在神經(jīng)元胞體內(nèi)部和中央神經(jīng)纖維網(wǎng)區(qū)有大量紅色和綠色熒光色素顆粒,這些顆粒圍繞細(xì)胞核周圍分布(圖2-5)。

2.3 免疫組化結(jié)果

為了鑒定和定位Glu、GABA、DA、Ach和5-HT神經(jīng)元,作者選用抗 Glu、GAD67(GABA合成限速酶)、TH(DA合成限速酶)、ChAT(Ach合成限速酶)和 TPH(5-HT合成限速酶)抗體,進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 Glu免疫陽(yáng)性神經(jīng)元

臟神經(jīng)節(jié)的整個(gè)胞體區(qū)都存在 Glu能神經(jīng)元。在胞體層較厚的區(qū)域,有大量小型細(xì)胞呈強(qiáng) Glu免疫陽(yáng)性反應(yīng),少量中型細(xì)胞呈弱 Glu免疫陽(yáng)性反應(yīng),且兩種細(xì)胞呈不規(guī)則散亂分布。在胞體層較薄的區(qū)域,可見少量大型Glu免疫陽(yáng)性細(xì)胞。中央纖維網(wǎng)有零星的陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)末梢存在(圖3-1,圖3-2)。

2.3.2 GAD67免疫陽(yáng)性神經(jīng)元

臟神經(jīng)節(jié)的外側(cè)胞體區(qū)可見大量呈陽(yáng)性反應(yīng)的小型細(xì)胞,少數(shù)中型細(xì)胞呈弱陽(yáng)性。這些陽(yáng)性細(xì)胞多為單級(jí)神經(jīng)元,其軸突進(jìn)入神經(jīng)節(jié)中央纖維網(wǎng)。中央纖維網(wǎng)區(qū)中可見豐富的GAD67強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的神經(jīng)纖維,呈不規(guī)則絮狀排列,并有少量陽(yáng)性神經(jīng)纖維呈靜脈曲張狀突起(圖3-3,3-4)。

圖1 褶紋冠蚌臟神經(jīng)節(jié)的組織切片(H.E染色)Fig.1 The hematoxylin and eosin staining of the visceral ganglion

圖2 褶紋冠蚌臟神經(jīng)節(jié)自發(fā)熒光現(xiàn)象Fig.2 The occurrence of autofluorescence in the visceral anglion

圖3 褶紋冠蚌臟神經(jīng)節(jié)Glu、GABA、DA、ChAT、5-HT神經(jīng)元的SP法免疫組化定位Fig.3 SP immunohistochemical locanization of Glu,GABA,DA,Ach and 5-HT neurons in the visceral ganglia of Cristaria plicata

2.3.3 TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元

臟神經(jīng)節(jié)的整個(gè)胞體區(qū)及神經(jīng)節(jié)周圍的結(jié)締組織鞘均見TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞。在大量細(xì)胞成簇出現(xiàn)的區(qū)域,TH免疫陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)元大部分為小型胞體;偶見呈TH免疫陽(yáng)性反應(yīng)的大型神經(jīng)元; 中央纖維網(wǎng)區(qū)可見零星的陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)末稍(圖3-5,3-6)。

2.3.4 ChAT免疫陽(yáng)性神經(jīng)元

臟神經(jīng)節(jié)背內(nèi)側(cè)靠近外套神經(jīng)的胞體區(qū)有大量的中型細(xì)胞呈強(qiáng) ChAT陽(yáng)性反應(yīng); 在中央神經(jīng)纖維網(wǎng)中成簇放射狀?yuàn)A雜排列的神經(jīng)元中,也有少數(shù)中型細(xì)胞呈強(qiáng) ChAT陽(yáng)性反應(yīng),并夾雜有少量大型細(xì)胞亦呈弱 ChAT陽(yáng)性反應(yīng)。鰓神經(jīng)根部有少量中型細(xì)胞聚集分布; 中央纖維網(wǎng)區(qū)可見較豐富的 ChAT陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)末梢(圖3-7,3-8)。

2.3.5 TPH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元

臟神經(jīng)節(jié)胞體區(qū)大量神經(jīng)元呈TPH免疫陽(yáng)性細(xì)胞,靠近外套神經(jīng)和鰓神經(jīng)區(qū)域尤為明顯。大部分免疫陽(yáng)性細(xì)胞為大、中型神經(jīng)元,偶見小型的免疫陽(yáng)性神經(jīng)元; 中央纖維網(wǎng)區(qū)只分布有顏色較淺的細(xì)小陽(yáng)性反應(yīng)纖維或末梢(圖3-9,3-10)。

3 討論

從解剖學(xué)看,瓣鰓綱褶紋冠蚌的臟神經(jīng)節(jié)與腹足綱和頭足綱種類有較大不同：腹足綱的臟神經(jīng)節(jié)位于食管末端處,形小、無(wú)愈合,彼此有神經(jīng)相連[12-13]; 頭足綱的臟神經(jīng)節(jié)在腦的腹面與平衡器相鄰,從背面觀其狀似四角形[14]; 而淡水褶紋冠蚌臟神經(jīng)節(jié)位于后閉殼肌腹側(cè),愈合,呈典型的蝴蝶狀,海洋瓣鰓綱種類(例如,疣簾蛤)的臟神經(jīng)節(jié)為“X”型[15]。對(duì)臟神經(jīng)節(jié)進(jìn)行組織學(xué)比較后發(fā)現(xiàn),瓣鰓綱不同種類之間存在差異：櫛孔扇貝(Chlamys farreri)胞體區(qū)含小型(5～15 μm)、大型細(xì)胞(15～36 μm)[16]; 淡水褶紋冠蚌神經(jīng)節(jié)胞體區(qū)含有小型(5～15 μm)、中型(15～35 μm)和大型(35～50 μm)3 類細(xì)胞。這些差異可能與不同種類軟體動(dòng)物生活的環(huán)境、行使的功能和所包含的神經(jīng)遞質(zhì)含量等差異有關(guān)[8]。

在褶紋冠蚌臟神經(jīng)節(jié),3種類型神經(jīng)元均有自發(fā)的紅色和綠色熒光,且紅色熒光占主導(dǎo)。文獻(xiàn)報(bào)道,無(wú)齒蚌臟神經(jīng)節(jié)中的自發(fā)綠色熒光較黃色熒光占主導(dǎo)[17]; 貽貝的腦、臟神經(jīng)節(jié)自發(fā)橙黃熒光較綠色熒光占主導(dǎo)[18]。由于黃色熒光蛋白的激發(fā)光帶為490～510 nm,而本實(shí)驗(yàn)使用的兩種激發(fā)光均不在此發(fā)光帶內(nèi),故無(wú)法觀察到自發(fā)黃色熒光。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究褶紋冠蚌神經(jīng)元是否有其他波長(zhǎng)的自發(fā)熒光奠定了基礎(chǔ)。

自發(fā)熒光是海洋無(wú)脊椎動(dòng)物普遍存在的現(xiàn)象。例如,一些腔腸動(dòng)物(水母、水螅和珊瑚)在受到機(jī)械刺激時(shí)會(huì)發(fā)射綠色熒光,櫛水母類則發(fā)射藍(lán)色熒光[19]。文獻(xiàn)報(bào)道,生物胺類物質(zhì)如多巴胺、5-羥色胺等經(jīng)甲醛處理后可顯示不同的熒光。由于褶紋冠蚌臟神經(jīng)節(jié)胞體存在自發(fā)紅、綠熒光現(xiàn)象,本實(shí)驗(yàn)無(wú)法運(yùn)用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行雙標(biāo)實(shí)驗(yàn),以分析不同神經(jīng)遞質(zhì)的共存現(xiàn)象,這一問(wèn)題亟待在今后的研究中解決。

為了研究褶紋冠蚌臟神經(jīng)節(jié)內(nèi)不同遞質(zhì)神經(jīng)元的分布模式,作者采用了冰凍切片技術(shù)及SP免疫組化方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,這一方法可以清晰地觀察到Glu、GABA、DA、Ach和5-HT能神經(jīng)元的分布規(guī)律及主要特征,不同種類神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)和分布有所不同。許多研究表明,Glu在軟體動(dòng)物的主要功能是參與各種運(yùn)動(dòng)機(jī)能的調(diào)節(jié),如攝食[20]、游泳[21]。GABA參與調(diào)節(jié)軟體動(dòng)物的各種運(yùn)動(dòng)功能。例如,靜水椎實(shí)螺(Lymnaea stagnalis)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和支配某些肌肉的神經(jīng)中均有GABA神經(jīng)元。在一些軟體動(dòng)物貽貝(Mytilus galloprovincialis)、蛤蜊(Venerupis pullastra)和牡蠣(Ostera edulis)),GABA能誘導(dǎo)幼蟲的附著和變態(tài)[22]。

文獻(xiàn)報(bào)道,DA 在軟體動(dòng)物攝食方面起著重要的作用。在軟體動(dòng)物腹足綱中,DA參與調(diào)節(jié)食物的攝取量。在海兔中,DA在學(xué)習(xí)和記憶功能方面起重要的作用。Ach是軟體動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)遞質(zhì)。例如,支配海兔攝食肌肉的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以Ach為遞質(zhì)。5-HT則參與調(diào)控多種功能。在瓣鰓綱,5-HT控制鰓和纖毛運(yùn)動(dòng)[23],控制出、入水管的肌肉運(yùn)動(dòng),并參與攝食和學(xué)習(xí)過(guò)程[9]。5-HT還參與性別功能的神經(jīng)調(diào)控,與生殖發(fā)育有關(guān)[24-26]。

本實(shí)驗(yàn)表明,Glu、GABA、DA、Ach和5-HT能神經(jīng)元在褶紋冠蚌臟神經(jīng)節(jié)中均有分布。其中GABA能神經(jīng)元含量較少; GABA能神經(jīng)纖維廣泛分布于中央纖維網(wǎng),少數(shù) GABA能神經(jīng)纖維具有靜脈曲張狀的突起,推測(cè) GABA神經(jīng)元在整個(gè)神經(jīng)節(jié)內(nèi)參與大范圍、遠(yuǎn)距離的神經(jīng)活動(dòng)調(diào)節(jié)。5-HT能神經(jīng)元大量聚集在外套神經(jīng)和鰓神經(jīng)附近,推測(cè)5-HT作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)在不同神經(jīng)節(jié)之間起到交流作用,可能參與調(diào)控褶紋冠蚌的運(yùn)動(dòng)及生殖功能。關(guān)于這 5種神經(jīng)遞質(zhì)在褶紋冠蚌臟神經(jīng)節(jié)的具體生理功能,有待今后的進(jìn)一步研究。

致謝：本實(shí)驗(yàn)的部分實(shí)驗(yàn)在南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院完成,部分實(shí)驗(yàn)在復(fù)旦大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究所完成。感謝徐開靜和單紅英兩位老師在實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面給予的協(xié)助。

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