王靜香,李加兒,區(qū)又君

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所,廣東 廣州 510300;2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海201306)

魚(yú)類的血液量較少,僅占體質(zhì)量的 2%左右[1],但在生命活動(dòng)中卻起著非常重要的作用。目前,國(guó)內(nèi)外已有許多學(xué)者對(duì)魚(yú)類血液進(jìn)行了研究,Valenzuela[2]、Ballarin[3]、Gao等[4]分別對(duì)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、波紋短須石首魚(yú)(Umbrina cirrosa)、泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)血液參數(shù)方面進(jìn)行了研究;李長(zhǎng)嶺[5]、陳剛[6]、蘇友祿等[7]分別對(duì)大彈涂魚(yú)(Boleophthalmus pectinirosris)、軍曹魚(yú)(Rachycentron canadum)的血細(xì)胞的發(fā)生進(jìn)行了研究;還有一些學(xué)者對(duì)紅鰭笛鯛(Lutjanus erythopterus)[8]、黑鰭冰魚(yú)(Chaenocephalus aceratus)[9]、達(dá)氏鰉(Huso dauricus)[10]、歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)[11]、條石鯛(Oplegnanathus fasciatus)[12]、鯽

(Carassius auratus)[13]鲹、卵形鯧(Trachinotus ovatus)[14]等魚(yú)外周血細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行了研究。有關(guān)駝背鱸的研究主要集中在形態(tài)和生物學(xué)性狀[15]、胚胎發(fā)育[16]、配合飼料研制[17]、線粒體細(xì)胞色素 b基因的序列分析[18]等方面,但在外周血細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)方面尚未見(jiàn)過(guò)報(bào)道。

駝背鱸(Cromileptes altivelis),俗稱老鼠斑,隸屬科(Serranidae)、石斑魚(yú)亞科(Epinephelinae)、駝背鱸屬(Cromileptes)[15],是一種高級(jí)海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)食用魚(yú)類,價(jià)格昂貴。目前世界上已知的駝背鱸僅 1種,廣布于印度太平洋的暖水海域,東至菲律賓,西至非洲,南至澳大利亞海域,北至日本,中國(guó)見(jiàn)于南海。作者就駝背鱸外周血細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,旨在為駝背鱸的生理學(xué)、繁殖生物學(xué)和病理學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用15尾駝背鱸于2009年9月采自廣州市黃沙水產(chǎn)市場(chǎng),雌雄兼有,健康無(wú)病。體長(zhǎng)為(26.48±1.08)cm,體質(zhì)量為(465.75±97.96) g/尾。

1.2 方法

1.2.1 取材

用0.1 %肝素鈉潤(rùn)洗過(guò)的無(wú)菌注射器,魚(yú)體尾部血管采血,一部分傾入肝素鈉潤(rùn)洗過(guò)的試管中用作血細(xì)胞計(jì)數(shù)的原液,另一部分用于制作血涂片。

1.2.2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)

將試管中的血液分為兩份,一份用 0.65 %NaCl溶液將血液稀釋 100倍,用于紅細(xì)胞的計(jì)數(shù);另一份用2 mL冰醋酸,98 mL蒸餾水,10 g/L亞甲基藍(lán)溶液 3滴配制的溶液將血液稀釋 10倍用于白細(xì)胞的計(jì)數(shù)。用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.3 光鏡樣品制備

常規(guī)方法制作血涂片,每尾魚(yú)血涂片 10張,將其中的5張玻片用Wright’s和Giemsa雙重染色法染色,剩余5張入95 %酒精固定10 min,然后浸入蘇木精染液染色5 min,流水沖洗5 min,再入伊紅染液染色 2 min,最后進(jìn)行常規(guī)脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。每尾魚(yú)選取 5張血涂片(用 Wright’s和Giemsa雙重染色法),隨機(jī)選取100個(gè)視野,根據(jù)血細(xì)胞的形態(tài)差異和細(xì)胞的著色差異[6]對(duì)其上的2 916個(gè)白細(xì)胞在 Olympus顯微鏡油鏡下進(jìn)行分類計(jì)數(shù),同時(shí)進(jìn)行拍照,測(cè)定血細(xì)胞(核)大小。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式描述,并采用Excel和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 血細(xì)胞的測(cè)定及分類計(jì)數(shù)

通過(guò)觀察和測(cè)定駝背鱸各類血細(xì)胞,結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中可得出,各類白細(xì)胞所占比例依次為:淋巴細(xì)胞 37.26%,血栓細(xì)胞 30.82%,嗜中性粒細(xì)胞23.57%,單核細(xì)胞8.35%,嗜酸性粒細(xì)胞極少見(jiàn)到。此外,對(duì)血細(xì)胞的數(shù)量統(tǒng)計(jì)中紅細(xì)胞數(shù) 1.746 2×106個(gè)/mm3,白細(xì)胞數(shù) 4.781 7×103個(gè)/mm3。

表1 駝背鱸血細(xì)胞的大小和白細(xì)胞的分類統(tǒng)計(jì)值Tab.1 Sizes of the blood cells and classified statistics of white blood cells of Cromileptes altivelis

2.2 紅細(xì)胞

正常成熟的紅細(xì)胞呈圓形或橢圓形(圖1-1),核呈圓形、橢圓形,外周血中也可看到處于不同發(fā)育階段的紅細(xì)胞,細(xì)胞核呈分葉型(像正在分裂的細(xì)胞核)(圖1-2)、也有不規(guī)則的形狀。位于細(xì)胞中央或偏側(cè)。細(xì)胞表面光滑,核質(zhì)比接近1。細(xì)胞的胞膜清晰,胞質(zhì)中血紅蛋白含量豐富且分布均勻。油鏡下觀察,細(xì)胞核的核膜清晰可見(jiàn),核內(nèi)染色質(zhì)豐富呈網(wǎng)狀排列或零散。在駝背鱸的血涂片中可以看到幼紅細(xì)胞(圖1-3),細(xì)胞圓形或不規(guī)則形,胞核居中較正常紅細(xì)胞大,胞質(zhì)呈堿性被 Wright’s和Giemsa雙重染色染成灰藍(lán)色,被改良的方法染成淺粉色,與淋巴細(xì)胞類似。此外,也可看到解體的紅細(xì)胞(圖1-4)、細(xì)胞膜破裂的紅細(xì)胞即過(guò)渡型(圖1-5,1-6)以及“核影”紅細(xì)胞(圖1-7)。解體的紅細(xì)胞,胞質(zhì)變淺,區(qū)域擴(kuò)大,形狀不規(guī)則,胞核也逐漸增大,顏色變淺,圓形或不規(guī)則形。而核影紅細(xì)胞,沒(méi)有細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)裸核狀態(tài),與解體的紅細(xì)胞相比,其細(xì)胞核更大,隨著細(xì)胞核的擴(kuò)大,染色質(zhì)逐漸變淺最終消失。在駝背鱸血涂片中也可以看到正在分裂的紅細(xì)胞(圖1-8)。

圖1 駝背鱸的紅細(xì)胞Fig.1 Erythrocyte of Cromileptes altivelis

2.3 粒細(xì)胞

在駝背鱸的血涂片中,可以看到嗜酸性粒細(xì)胞(圖2-1)和嗜中性粒細(xì)胞(圖2-2,2-3,2-4),沒(méi)發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞。嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量比較多,細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則。細(xì)胞核腎形或分葉型,通常位于細(xì)胞的一側(cè),胞質(zhì)顏色清亮,細(xì)胞膜明顯,與淋巴細(xì)胞相比粒細(xì)胞胞質(zhì)相對(duì)較多。嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量較少,細(xì)胞形狀不規(guī)則,細(xì)胞核呈圓形。胞質(zhì)中有被染成橘紅色的顆粒。同時(shí)也能看到中性粒細(xì)胞的集群和白細(xì)胞聚集的現(xiàn)象(圖2-5,2-6)。

圖2 駝背鱸的粒細(xì)胞Fig.2 Granulocyte of Cromileptes altivelis

2.4 單核細(xì)胞

單核細(xì)胞是白細(xì)胞中體積較大的一類,與嗜中性粒細(xì)胞很難區(qū)分。細(xì)胞呈圓形、橢圓形或形狀不規(guī)則(圖3-1),細(xì)胞邊緣粗糙。細(xì)胞質(zhì)豐富呈堿性,被染成深藍(lán)色。胞質(zhì)中含有少量的空泡(圖3-2),且胞質(zhì)有偽足外伸的現(xiàn)象。細(xì)胞核圓形、卵圓形、腎形、菱形、也有不規(guī)則的形狀通常偏于一側(cè),也有的居中。細(xì)胞核占整個(gè)細(xì)胞的1/3～1/2。偶爾也可見(jiàn)到細(xì)胞核呈啞鈴型或長(zhǎng)條形偏于一側(cè),與細(xì)胞膜相切,中央有一個(gè)很大的空泡,空泡外有一層薄薄的細(xì)胞質(zhì)(圖3-3)。

圖3 駝背鱸的單核細(xì)胞Fig.3 Monocyte of Cromileptes altivelis

2.5 淋巴細(xì)胞

在駝背鱸的血涂片中可看到 3種淋巴細(xì)胞(圖4-1,4-2,4-3):大淋巴細(xì)胞,中淋巴細(xì)胞,小淋巴細(xì)胞。小淋巴細(xì)胞細(xì)胞核比紅細(xì)胞的細(xì)胞核小或接近。中淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核略大于紅細(xì)胞細(xì)胞核,大淋巴細(xì)胞核比紅細(xì)胞細(xì)胞核大得多。淋巴細(xì)胞都有類似圓形的細(xì)胞核,胞質(zhì)少,細(xì)胞表面不光滑,通常有偽足樣的突起。有時(shí)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈鐮刀狀,緊貼在胞核的一側(cè)(圖4-4)。

2.6 血栓細(xì)胞

血栓細(xì)胞的細(xì)胞核呈長(zhǎng)桿狀、橢圓形、圓形、紡錘形,胞質(zhì)少,核質(zhì)比大,細(xì)胞表面光滑,體積小,外形表現(xiàn)多樣,有蝌蚪形(圖4-5)、紡錘形(圖4-6)、水滴形(圖4-7)、短棒形(圖4-8),一般單獨(dú)存在,有時(shí)可見(jiàn)到正在分裂的血栓細(xì)胞(圖4-9)。

3 討論

3.1 幾種魚(yú)類血細(xì)胞數(shù)量的比較

魚(yú)類的血液中主要存在紅細(xì)胞、血栓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞5種血細(xì)胞,駝背鱸的血細(xì)胞與大多數(shù)魚(yú)類相似,形態(tài)差異不明顯,僅白細(xì)胞中各細(xì)胞所占的比例有所差異。有的學(xué)者[19]研究表明血栓細(xì)胞數(shù)目最多,嗜酸性細(xì)胞的數(shù)量最少(嗜堿性細(xì)胞一般很難看到),也有學(xué)者[11]發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞的數(shù)量最多,嗜酸性細(xì)胞最少。駝背鱸的外周血細(xì)胞中淋巴細(xì)胞數(shù)量最多,嗜酸性細(xì)胞最少。各白細(xì)胞出現(xiàn)數(shù)量的差異,作者推測(cè)可能有兩方面的原因造成的,一是魚(yú)類處于不同的生理狀態(tài);二是在血涂片制作過(guò)程中涂片不均勻或計(jì)數(shù)過(guò)程中重復(fù)和錯(cuò)誤判斷。

圖4 駝背鱸的淋巴細(xì)胞和血栓細(xì)胞Fig.4 Lymphocyte and thrombocyte of Cromileptes altivelis

在血細(xì)胞的數(shù)量上,作者將駝背鱸血細(xì)胞的數(shù)量與軍曹魚(yú)[6]、達(dá)氏鰉[10]、卵形鯧鲹[14]、斑點(diǎn)叉尾(Ictalurus punctatus)[20]、鰱(Hypophthalmichys molitrix)[21]等魚(yú)血細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較。從表2可見(jiàn)海水魚(yú)類如駝背鱸、卵形鯧鲹、軍曹魚(yú)以及淡水魚(yú)如斑點(diǎn)叉尾等魚(yú)類的紅細(xì)胞數(shù)量均多于達(dá)氏鰉,駝背鱸的紅細(xì)胞數(shù)量略少于鰱;達(dá)氏鰉和鰱的白細(xì)胞數(shù)量均大于駝背鱸、軍曹魚(yú)、卵形鯧鲹、斑點(diǎn)叉尾。經(jīng)方差分析和多重比較,結(jié)果表明:在紅細(xì)胞數(shù)量上,駝背鱸、達(dá)氏鰉、鰱、斑點(diǎn)叉尾、卵形鯧鲹、軍曹魚(yú)兩兩之間差異均顯著(P＜0.05);在白細(xì)胞數(shù)量方面,駝背鱸與斑點(diǎn)叉尾、斑點(diǎn)叉尾與卵形鯧鲹、卵形鯧鲹與軍曹魚(yú)、達(dá)氏鰉與鰱之間差異不顯著(P＞0.05),其余差異均顯著(P＜0.05)。從以上結(jié)論可以看出不同魚(yú)類的血細(xì)胞在數(shù)量上有一定的差異,王義強(qiáng)[22]等認(rèn)為魚(yú)類的血細(xì)胞數(shù)量會(huì)因魚(yú)類生存環(huán)境、生理狀況、種類、年齡、疾病、季節(jié)變化、取血部位不同(如從心臟或尾動(dòng)脈處取血)等各種因素變化而有所不同。

3.2 駝背鱸紅細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)及其功能

駝背鱸的血涂片中觀察到了成熟的紅細(xì)胞、幼稚紅細(xì)胞、解體的紅細(xì)胞、正在分裂的紅細(xì)胞以及核影。在歐洲鰻鱺[11]、條石鯛[12]、卵形鯧鲹[14]、花尾胡椒鯛(Plectorhinchus cinctus)[23]、史氏鱘(Acipenser schrencki)[24]、海鰻(Muraenesox cinereiu)[19]等硬骨魚(yú)類的外周血中也觀察到了直接分裂的紅細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明魚(yú)類的紅細(xì)胞除經(jīng)造血器官生成外,還可通過(guò)直接分裂而產(chǎn)生。駝背鱸的血涂片中存在很多分葉核,類似有絲分裂的細(xì)胞核,Ellis[25]把紅細(xì)胞核產(chǎn)生分葉的現(xiàn)象認(rèn)為是病態(tài)的斷裂增殖或一種紅細(xì)胞衰老方式。

紅細(xì)胞作為魚(yú)類血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞,同時(shí)也是魚(yú)類體內(nèi)通過(guò)血液運(yùn)送氧氣的最主要的媒介。在駝背鱸的紅細(xì)胞中有一些幼稚紅細(xì)胞,呈圓形略大于成熟紅細(xì)胞,胞質(zhì)染成淺藍(lán)色。根據(jù)紅細(xì)胞的發(fā)生,由原紅細(xì)胞經(jīng)幼稚紅細(xì)胞到成熟紅細(xì)胞,胞體及胞核均由大變小,形態(tài)由圓形變?yōu)闄E圓形,核固縮濃染[26],這一點(diǎn)在駝背鱸外周血中得到證實(shí)。此外,還觀察到“核影”和解體的紅細(xì)胞,“核影”是紅細(xì)胞膜破裂,胞質(zhì)外溢擴(kuò)散消失,細(xì)胞核裸露,染色質(zhì)疏松,逐漸解體而形成;而解體紅細(xì)胞只是正常紅細(xì)胞到“核影”形成的一個(gè)過(guò)渡類型。造成駝背鱸血涂片中這一現(xiàn)象的原因,作者認(rèn)為首先是細(xì)胞衰老達(dá)到正常壽命而自動(dòng)解體,其次可能是在制做血涂片過(guò)程中破壞了紅細(xì)胞。“核影”在紅鰭笛鯛[8]、海鰻[19]的血涂片中也廣泛存在。

表2 不同魚(yú)類血細(xì)胞數(shù)量的比較Tab.2 Comparison of the blood cell counts among different fish species

3.3 駝背鱸白細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)及其功能

3.3.1 有粒白細(xì)胞

有粒白細(xì)胞有3種類型,嗜中性白血細(xì)胞、嗜酸性白血細(xì)胞和嗜堿性白血細(xì)胞。在駝背鱸的外周血涂片中可觀察到嗜中性白血細(xì)胞、嗜酸性白血細(xì)胞兩種細(xì)胞。嗜中性白血細(xì)胞具有吞噬作用,能做變形運(yùn)動(dòng)[27]。駝背鱸血涂片中嗜中性白血細(xì)胞數(shù)目最多,有的形狀不規(guī)則,細(xì)胞比較大,內(nèi)含空泡,證實(shí)了嗜中性白血細(xì)胞吞噬機(jī)能。嗜堿性白血細(xì)胞和嗜酸性白血細(xì)胞一般在魚(yú)類的血涂片中很少見(jiàn)到,Watson等[28]提出這兩種細(xì)胞的顆粒易溶于水,在制片中被溶解掉而不易被觀察。林光華等[29]在 100張革胡子鲇(Claris lareza)的血涂片上僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)嗜堿性粒細(xì)胞。金魚(yú)(Carassius auratusvar.)[28]外周血涂片中只見(jiàn)少量嗜堿性白血細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)中沒(méi)發(fā)現(xiàn)?；?Hemibarbus maculatus)[30]外周血中嗜酸性粒細(xì)胞較多,本實(shí)驗(yàn)中很少發(fā)現(xiàn)。

3.3.2 淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞

魚(yú)類淋巴細(xì)胞和哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞的形態(tài)很相似,按照大小可分為大小兩種。但 Ellis等[25]認(rèn)為不應(yīng)將淋巴細(xì)胞分為大小兩類,因?yàn)樗鼈冎皇遣煌δ軤顟B(tài)的同一種細(xì)胞不同表現(xiàn)形式;Barber[9]等發(fā)現(xiàn)許多淋巴細(xì)胞的體積是連續(xù)變化的,不應(yīng)該用大小來(lái)界定。但也有些學(xué)者將其分為大小兩類,認(rèn)為它們是具有不同功能的兩類細(xì)胞[31]。本次實(shí)驗(yàn)中,觀察到的淋巴細(xì)胞不僅有大與小的區(qū)別,其形狀也有較大差異。作者將介于大小淋巴細(xì)胞之間的淋巴細(xì)胞稱為中淋巴細(xì)胞。駝背鱸的外周血淋巴細(xì)胞形態(tài)明顯不同,是否在功能上也有明顯不同,有待對(duì)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和生物學(xué)意義進(jìn)一步研究。

單核細(xì)胞存在于所有脊椎動(dòng)物中,擔(dān)負(fù)著非特異性免疫的重要作用[32]。魚(yú)類單核細(xì)胞很少,在一些魚(yú)的血液中未見(jiàn)單核細(xì)胞,如:鯽[13]。駝背鱸血液中存在單核細(xì)胞,有的圓形,有的不規(guī)則,胞質(zhì)中含有空泡,說(shuō)明單核細(xì)胞具有吞噬機(jī)能。許多學(xué)者對(duì)紅鰭笛鯛[8]、歐洲鰻鱺[11]、條石鯛[12]的研究中也證實(shí)這一點(diǎn)。

3.3.3 血栓細(xì)胞

魚(yú)類的“血小板”即血栓細(xì)胞,是白細(xì)胞中體積較小的一種細(xì)胞,與小淋巴細(xì)胞較難區(qū)分,具有許多種形態(tài),在駝背鱸的血涂片中觀察到4種形態(tài):蝌蚪形、短棒形、水滴形和紡錘形。軍曹魚(yú)[6]中可見(jiàn)多種形態(tài)的血栓細(xì)胞,歐洲鰻鱺[11]有5種形態(tài),鰈[33]、日本白鯽(Carassius auratus cuvieri)[34]有4種形態(tài)的血栓細(xì)胞,表明血栓細(xì)胞的形態(tài)因魚(yú)的種類而有差別。許多研究報(bào)道表明不同形態(tài)的血栓細(xì)胞是其凝血功能狀態(tài)的反映[35]。Barber等[9]推測(cè)不同形態(tài)顯示了不同的發(fā)育時(shí)期或不同的功能狀態(tài),也表明種間存在著差異。同時(shí),在觀察血栓細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)現(xiàn),血涂片中紅血細(xì)胞凝血比較多的片子中,血栓細(xì)胞比較多。本文將駝背鱸血栓細(xì)胞歸為白細(xì)胞中的一種,與條石鯛[12]、卵形鯧鲹[14]的血栓細(xì)胞的分類一致;也有的將血栓細(xì)胞歸為白細(xì)胞以外的一種血細(xì)胞,如鰱、鳙(Aritichthys nobilis)[36]。

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