隋曉偉,任 偉,閆文華,劉升平,楊 寧

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,山東 青島266109;2.山東威海高綠集團(tuán)有限公司,山東 榮成 264318)

海帶是重要的經(jīng)濟(jì)海藻之一,應(yīng)用價(jià)值較高[1]：其產(chǎn)品在醫(yī)藥、食品、化工等方面有廣泛應(yīng)用;海帶是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,對(duì)于維持海洋生態(tài)平衡,增加海洋漁業(yè)資源,海洋富營養(yǎng)化等的生態(tài)修復(fù)等發(fā)揮了重要作用[2]。

海帶的生活史具有明顯的孢子體和配子體的世代交替現(xiàn)象[3],配子體階段盡管在生活史中時(shí)間短、個(gè)體小,但生物學(xué)意義重大,尤其是配子體克隆技術(shù)的應(yīng)用為育種、種質(zhì)保存等發(fā)揮了巨大的作用。

光是影響植物光合作用、光形態(tài)建成、不適情況下造成光損傷的重要的環(huán)境因子。光質(zhì)、光強(qiáng)能夠調(diào)節(jié)光合作用不同類型葉綠體蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成以及光系統(tǒng)Ⅱ和光系統(tǒng)I間的電子傳遞。Shi等[4]研究發(fā)現(xiàn)海帶胚孢子的萌發(fā)不依賴于光質(zhì)與光強(qiáng),而配子體的生長速度隨著紅藍(lán)光光強(qiáng)的增高而加快,藍(lán)光的刺激效應(yīng)比紅光強(qiáng);配子體的受精依賴于藍(lán)光,而且只有藍(lán)光照射強(qiáng)度達(dá)到一定程度才能產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)。自然光下的海帶代謝活動(dòng)主要是受到白光調(diào)控,但是單色光對(duì)海帶生長發(fā)育以及一些酶的影響越來越受到關(guān)注。

作者于2009年至2010年先后通過3次實(shí)驗(yàn),研究了藍(lán)、綠、紅3種主要波段的單色光,在不同光強(qiáng)下對(duì)海帶配子體的生長、發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用海帶(Laminaria japonicaAresch)于2009年8月取自山東榮成俚島灣。

1.1.2 培養(yǎng)液

培養(yǎng)液按自然海水加NaNO3-N：2×10-6g/L;KH2PO4-P：0.2×10-6g/L;煮沸消毒后使用。

1.1.3 光源

白光由熒光燈提供,藍(lán)光、綠光、紅光由 LED燈提供,其波長分別為藍(lán)光 450～480 nm,綠光480～550 nm,紅光 640～750 nm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取有成熟孢子囊的海帶,洗刷消毒后,陰干刺激2 h,于10℃消毒海水中放散游孢子,游孢子的密度達(dá)到每100 X視野下約10～15游孢子時(shí)結(jié)束放散;以載玻片做附著基,當(dāng)100 X視野下附著約15～20個(gè)胚孢子時(shí)收集載玻片,進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段。不同光質(zhì)分別設(shè)定了不同的光照強(qiáng)度,每種光強(qiáng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,具體光強(qiáng)設(shè)定如下：

藍(lán)光(lx)：2000、1100、800、600、350、200、100、50;

綠光(lx)：3200、1600、800、400、200、100;

紅光(lx)：2700、1500、750、500、250、100;

以白光(1000 lx)下培養(yǎng)作為對(duì)照。

各組實(shí)驗(yàn)的光照周期12L：12D,培養(yǎng)溫度10 ℃,每天更換培養(yǎng)液1次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

光鏡下觀察配子體的生長發(fā)育情況,每天用顯微鏡和LY-WN-HP SUPER CCD萬能視頻成像裝置測量配子體的長度變化,排卵之后記錄排卵數(shù),以排卵率來表示。

配子體平均生長速度N=(Xn-X0)／(tn-t0),式中N為平均生長速度;Xn、X0當(dāng)天和初始的配子體長短直徑的平均長度;tn、t0分別為對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)天數(shù)。

配子體的排卵率=排卵細(xì)胞數(shù)／(配子體數(shù)+排卵數(shù))×100%

產(chǎn)生無性繁殖時(shí)的排卵率=排卵細(xì)胞數(shù)／(配子體數(shù)+排卵數(shù)+未排卵的無性繁殖的細(xì)胞數(shù))×100%

數(shù)據(jù)采用spss軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 光質(zhì)對(duì)配子體生長的影響

不同光質(zhì)各光強(qiáng)梯度下配子體的生長速度(圖1)表明,藍(lán)光條件下配子體的生長速度相對(duì)較快。在50～2 000 lx的實(shí)驗(yàn)光強(qiáng)范圍內(nèi),50 lx時(shí),配子體的生長速度緩慢,隨著光照強(qiáng)度的增加,配子體的生長速度逐漸增加,光強(qiáng)達(dá)到 800 lx以上時(shí)生長速度開始大于對(duì)照組,2 000 lx時(shí)達(dá)到最大。方差分析顯示,在600～1 100 lx藍(lán)光下與白光比較配子體生長差異不顯著。而2 000 lx藍(lán)光條件下配子體的生長具有明顯的優(yōu)勢;但高光強(qiáng)的藍(lán)光照射的配子體易發(fā)生無性繁殖形成絲狀體,在初次排卵階段800、1 100、2 000 lx實(shí)驗(yàn)組的配子體形成絲狀體的比率分別為28%、35%、47%,呈現(xiàn)隨著光強(qiáng)的增加而提高的趨勢。

綠光在100～3 200 lx光照強(qiáng)度范圍內(nèi),隨著光強(qiáng)的增加,配子體的生長速度逐漸增加;方差分析顯示：在1 600 lx以下,配子體的生長速度顯著小于白光,3 200 lx時(shí)生長速度達(dá)到最大,與白光的生長速度相近;高光強(qiáng)的綠光照射下也容易形成絲狀體,初次排卵時(shí)綠光1 600、3 200 lx的絲狀體形成比率分別為31%、53%。

紅光在100～2 700 lx的光強(qiáng)范圍內(nèi),隨著光強(qiáng)的增加,配子體的生長速度逐漸增加,但其生長速度顯著低于白光的生長速度;與藍(lán)光、綠光相似,高光強(qiáng)的紅光也能誘導(dǎo)絲狀體的發(fā)生,排卵階段紅光1 500、2 700 lx的絲狀體形成比率分別為37%、38%。

2.2 光質(zhì)對(duì)配子體發(fā)育的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同光質(zhì)各光強(qiáng)梯度配子體初次排卵的時(shí)間及排卵率差別較大,見表1。

圖1 不同光質(zhì)、光強(qiáng)條件下配子體的平均生長速度及多重比較分析Fig.1 The average growth rates under lights with various wavelengths and intensities

2.2.1 不同光質(zhì)對(duì)配子體初次排卵時(shí)間的影響

藍(lán)光在 350 lx以上光強(qiáng)條件下,配子體的發(fā)育速度都達(dá)到或超過白光組;而綠光1 600 lx以下都達(dá)不到白光的發(fā)育速度,只有在3 200 lx的強(qiáng)光條件下才與白光接近;而紅光在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的光強(qiáng)條件下排卵時(shí)間都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過白光對(duì)照,排卵量極低(表1)。

2.2.2 不同光質(zhì)對(duì)配子體排卵率的影響

從排卵率的指標(biāo)看,除了藍(lán)光在 200～600 lx范圍內(nèi),優(yōu)于白光對(duì)照外,其他(包括其他波長光)實(shí)驗(yàn)組別都低于白光;綠光在1 600 lx時(shí)排卵率最高,但排卵時(shí)間推遲,排卵率大幅度低于白光;而紅光在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)只有個(gè)別排卵現(xiàn)象。

2.2.3 不同光條件下初次排卵時(shí)配子體細(xì)胞大小的差異

由表1可以看出,不同光條件下配子體排卵前的平均直徑有較大差異,其中藍(lán)光條件下排卵前的平均直徑最小,在18.96～22.70 μm之間,小于白光的24.48 μm,而紅光最大,盡管在只有個(gè)別排卵的情況下,配子體的平均直徑已經(jīng)達(dá)到 24.70～25.53 μm 之間。

3 討論

3.1 光質(zhì)與配子體生長的關(guān)系

海藻生活于海洋,自然光通過海水時(shí),海水以及海水中的懸浮與溶解的物質(zhì)對(duì)不同波長光的吸收與散射不同,導(dǎo)致不同海域不同水深的光譜結(jié)構(gòu)不同,長期對(duì)環(huán)境的適應(yīng)與進(jìn)化的結(jié)果,形成了海藻色素的多樣性,而陸地高等植物的光合色素相對(duì)穩(wěn)定,因此對(duì)海藻進(jìn)行光質(zhì)方面的研究較陸生植物更有意義。單色光實(shí)驗(yàn)的目的不是為了選擇某一波長的光為最佳生長、發(fā)育條件,而是判斷某一海藻對(duì)各個(gè)波段光的需求,最終取得某種海藻在某一時(shí)期合理的光譜組合和劑量。摒棄無效和有害波段的光,最終獲取海藻最適宜的光條件：滿足光合作用和形態(tài)建成的需要,降低光損傷的程度。實(shí)驗(yàn)證明,促進(jìn)海帶配子體生長的,主要為藍(lán)光和綠光,紅光的作用較小,白光并非最佳條件。與Lüning[5]等提出的糖海帶(L.saccharina)配子體的生長速度與光質(zhì)無關(guān)不同,具體原因有待進(jìn)一步研究。

表1 不同光質(zhì)、光強(qiáng)條件下配子體的發(fā)育Tab.1 The reproduction of the gametophytes in different light quality,light intensity conditions

3.2 不同波長光的光強(qiáng)變化與海帶配子體生長的關(guān)系

目前大部分研究認(rèn)為配子體的生長速度隨著藍(lán)光、紅光光照強(qiáng)度的增加而增加,藍(lán)光刺激效應(yīng)最大[4-6]。單色光條件下,光照強(qiáng)度的變化對(duì)海帶配子體的生長影響較大,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),隨著光強(qiáng)的增加而提高,但是高光強(qiáng)條件下易于誘導(dǎo)無性繁殖的發(fā)生,該點(diǎn)有較大的實(shí)踐意義：在孢子水法海帶育苗中,配子體發(fā)生無性繁殖,往往會(huì)推遲排卵,導(dǎo)致幼苗大小差異過大,同時(shí),無性繁殖產(chǎn)生絲狀體后再排卵,發(fā)生的孢子體的假根不發(fā)達(dá)、不牢固,育苗后期容易出現(xiàn)脫苗;而在海帶配子體克隆技術(shù)中則需要配子體進(jìn)行無性繁殖,因此光強(qiáng)的調(diào)控可以作為輔助條件控制發(fā)育及無性繁殖。

3.3 海帶配子體發(fā)育與光質(zhì)的關(guān)系

從排卵時(shí)間和排卵率兩項(xiàng)指標(biāo)分析,在三種單色光中藍(lán)光對(duì)海帶配子體的發(fā)育的促進(jìn)作用最大,綠光其次,紅光最差,這個(gè)結(jié)果與對(duì)配子體生長的關(guān)系有些類似。Lüning[6-7]等認(rèn)為藍(lán)光促進(jìn)了配子體的發(fā)育,而紅光則起抑制作用。當(dāng)照射光的波長都大于512 nm時(shí),海帶配子體不能發(fā)育,對(duì)發(fā)育起作用的是400～512 nm的輻射能,與本研究相吻合。

而在各種光條件下呈現(xiàn)出隨著光強(qiáng)的提高發(fā)育加快的趨勢,但藍(lán)光和綠光在高光強(qiáng)條件下出現(xiàn)反復(fù),反復(fù)之后仍然有隨光強(qiáng)的提高而加快的現(xiàn)象,究其原因,是無性繁殖所致,前文述及配子體的無性繁殖也是隨著光強(qiáng)的提高而增大,高光強(qiáng)條件下,部分配子體先發(fā)生無性繁殖形成絲狀體,絲狀體的形成推遲了排卵,但隨著時(shí)間的繼續(xù)加長仍然是高光強(qiáng)條件下發(fā)育快。因此出現(xiàn)了隨著光強(qiáng)的提高配子體的發(fā)育速度提高,當(dāng)出現(xiàn)無性繁殖后發(fā)育速度減慢,但隨后又開始上升的現(xiàn)象。

實(shí)踐中,控制發(fā)育與無性繁殖有時(shí)是相互排斥的,如在孢子水育苗時(shí)我們不希望無性繁殖的發(fā)生,但在海帶配子體克隆擴(kuò)大培育時(shí)也不希望有排放精、卵現(xiàn)象的發(fā)生,那么在不同目的的實(shí)踐操作中控制適宜的光強(qiáng)很有必要。因此,孢子水育苗時(shí)將藍(lán)光控制在 350～600lx既可以保持配子體較快的生長速度,又可以有效預(yù)防無性繁殖的發(fā)生,同時(shí)能夠縮短配子體發(fā)育及完成排卵所需的時(shí)間,保證苗種大小規(guī)格的統(tǒng)一。

海帶的胚孢子萌發(fā)后形成的配子體首先要生長達(dá)到一定大小后才能排放精、卵,本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),光質(zhì)條件不同發(fā)育速度不同,同時(shí)排放精卵前配子體的大小也有差別,發(fā)育快的配子體個(gè)體小,配子體的發(fā)育是一個(gè)過程,在這個(gè)過程中需要進(jìn)行一些活性誘導(dǎo)物質(zhì)的釋放[8],不同光質(zhì)照射可能影響了這些誘導(dǎo)物質(zhì)的形成和釋放,因此導(dǎo)致了配子體的大小、發(fā)育時(shí)間和排卵率的不同。但配子體排卵階段個(gè)體的大小對(duì)將來的生長、發(fā)育的影響如何目前還不得而知,需要進(jìn)一步的探討。

4 結(jié)論

藍(lán)光、綠光、紅光對(duì)海帶配子體的生長都有促進(jìn)作用,其中藍(lán)光最大、綠光其次、紅光稍差于綠光。

對(duì)海帶配子體發(fā)育影響的主要因素是藍(lán)光,綠光也有一定作用。紅光的作用極少。

在一定范圍內(nèi),隨著光強(qiáng)的提高海帶配子體的生長、發(fā)育速度加快,但高光強(qiáng)容易誘導(dǎo)無性繁殖的發(fā)生,并由此推遲排放精、卵。

[1]劉濤,崔競進(jìn),戴繼勛,等.海帶配子體克隆的培養(yǎng)與應(yīng)用[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2000,30(2)：203-206.

[2]金振輝,劉巖,張靜,等.中國海帶養(yǎng)殖現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].海洋湖沼通報(bào),2009(1)：141-150.

[3]吳超元,索如瑛,曾呈奎,等.海帶養(yǎng)殖學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社,1962：14-33.

[4]Shi H Z Bressan R.RNA extraction[J].Methods in Molecular Biology,2006,323：345- 348.

[5]Lüning K,Neushul M.Light and temperature demands for growth and reproduction of Laminarian gametophyte in southern and central[J].California Mar Biol,1978,45：297-309.

[6]Lüning K,Dring M J.Reproducing,growth and photosynthesis of gametophytes of Laminaria saccharina growth in blue and red light[J].Mar Biol,1975,29(1)：195-200.

[7]Lüning K,Critical levels of light and temperature regulating the gametogenesis of three Laminariaspecies(Phaeophyceae) [J].J Phycol,1980,16(1)：1-15.

[8]Lüning K,Dring M J.Reproducing,growth and photosynthesis of gametophytes of Laminaria saccharina growth in blue and red light[J].Mar Biol,1975,29(1)：195-200.