張 勇 崔 巖

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,沈陽 110866)

近些年來,隨著生活水平的日益提高,消費(fèi)者對畜產(chǎn)品的品質(zhì)要求也越來越高,肉品質(zhì)的提高毫無疑問成為當(dāng)下討論的熱點(diǎn)之一,而嫩度則是衡量肉品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。宰后肌肉嫩化是改善肌肉嫩度的重要途徑之一,肌肉嫩化的發(fā)生普遍認(rèn)為是肌細(xì)胞的細(xì)胞骨架降解造成的[1]。而目前對于細(xì)胞骨架降解的機(jī)理研究大部分集中在鈣激活酶系統(tǒng)、組織蛋白酶系統(tǒng)和蛋白酶體上,有關(guān)于細(xì)胞凋亡在肌肉嫩化中的作用國內(nèi)外還鮮見報(bào)道。據(jù)證實(shí),核轉(zhuǎn)錄因子 -κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)與細(xì)胞凋亡存在密切關(guān)系,并參與多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[2]。

1 NF-κB概述

1.1 NF-κB的組成

NF-κB最早是于 1986年由 Sen和 Baltimore發(fā)現(xiàn),他們應(yīng)用凝膠電泳遷移率方法在 B淋巴細(xì)胞核提取物中檢測到一種能與免疫球蛋白 κ輕鏈基因的增強(qiáng)子 κB序列(GGG ACT TTCC)特異結(jié)合的核蛋白因子,并命名為 NF-κB。 NF-κB是細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,是細(xì)胞存活、細(xì)胞周期、細(xì)胞黏附和遷移的重要調(diào)節(jié)者[3]。

NF-κB是由 NF-κB/Rel蛋白家族成員 NF-κB1(p50,前體為 p105)、NF-κB2(p52,前體為 p100)、RelA(p65)、RelB和 C-Rel以同源或異源二聚體形式組成的。所有 NF-κB/Rel蛋白的 N端均有 1段由大約 300個(gè)氨基酸組成的 Rel同源結(jié)構(gòu)域(Rel homology dom ain,RHD),該結(jié)構(gòu)域包括二聚體化結(jié)構(gòu)域,IκB結(jié)合位點(diǎn),核定位信號和 DNA結(jié)合部位(NLS)。p65、RelB和 c-Rel的 C端含有轉(zhuǎn)錄激活域(transactivation domain),其中富含絲氨酸、酸性氨基酸和疏水性氨基酸,能直接作用于轉(zhuǎn)錄元件而激活轉(zhuǎn)錄過程,而 p50和 p52則無此結(jié)構(gòu)[4]。p50/p65發(fā)現(xiàn)最早,分布和作用最廣泛,是我們通常所說的 NF-κB,存在于細(xì)胞漿中[5-6]。目前已知存在于細(xì)胞質(zhì)中的 Rel/NF-κB蛋白復(fù)合物有 2種類型,即 Rel/NF-κB二聚體與 IκB家族結(jié)合所形成的三聚體以及 Rel蛋白與未裂解前體(如 p100)結(jié)合所形成的二聚體[7]。

1.2 NF-κB的激活

NF-κB的內(nèi)源性抑制因子主要是 IκB抑制蛋白家族 ,主要包括 IκBα、IκBβ、IκBε、IκBγ、Bcl3、p105和 p100。在細(xì)胞靜息狀態(tài)下,NF-κB與其抑制蛋白 IκB結(jié)合,組成異源多聚體(p50-p65-IκBα或 p50-p65-IκBβ),阻止 NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核 ,以非活性復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。不同的 IκB抑制 NF-κB的能力不同,它們與 NF-κB二聚體上的 RHD發(fā)生作用,掩蓋 NF-κB的 NLS,使之停留在胞質(zhì)而抑制 NF-κB核易位[8]。但是處于靜息狀態(tài)的成熟 B淋巴細(xì)胞等極少數(shù)細(xì)胞例外,它們的胞漿中存在活化的 NF-κB。NF-κB是一類具有和某些基因上啟動子區(qū)固定核苷酸序列結(jié)合而啟動基因轉(zhuǎn)錄的功能性蛋白質(zhì),所以諸多因素可以使NF-κB促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)[9]。

NF-κB的激活機(jī)制是一個(gè)較為復(fù)雜的過程,目前公認(rèn)的主要有 2條途徑：經(jīng)典途徑和旁路途徑[10-11]。當(dāng)細(xì)胞受到蛋白激酶 C、細(xì)胞因子、鈣離子載體等細(xì)胞外信號刺激時(shí),IκB激酶(IκB kinase,IKK)的亞單位 IKKβ由于磷酸化而激活,進(jìn)而作用于 NF-κB二聚體(p50/p65)與 IκB結(jié)合的復(fù)合物,引起 IκBα被磷酸化,IκBα磷酸化進(jìn)一步被泛素結(jié)合酶快速泛素化,然后在蛋白水解酶復(fù)合體作用下發(fā)生降解,從而將 NF-κB二聚體從三聚體(p50-p65-IκB)中釋放出來進(jìn)行核易位,與基因上的 κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合,進(jìn)而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用[12],這個(gè)過程即為經(jīng)典途徑。與經(jīng)典途徑不同的是,旁路途徑主要指 NF-κB中所含有的 p100或者 p105的二聚體被激活。在特定的細(xì)胞類型中,當(dāng)細(xì)胞受到外界信號刺激后,在 NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)的作用下使 IKKα和前體 p100磷酸化,經(jīng)蛋白激酶作用誘導(dǎo) NF-κB/p100產(chǎn)生 p52-RelB異源二聚體,并使其進(jìn)入細(xì)胞核與靶基因結(jié)合參與一系列的核轉(zhuǎn)錄活動[13]。

除此之外,近年的研究發(fā)現(xiàn),紫外線激活 NF-κB的機(jī)制與以上途徑均不相同。紫外線通過激活酪蛋白激酶 2(CK 2)引起 IκBα的 C端磷酸化,從而引起 IκBα泛素化后降解。CK 2的激活不依賴 IKK而是通過 p38絲裂原活化蛋白激酶,因此 p38-CK 2-IκBα也是激 活 NF-κB的 途徑之一[14]。

2 NF-κB與細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是指機(jī)體在一定生理、病理?xiàng)l件下為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,一個(gè)細(xì)胞接受其內(nèi)在指令而自動結(jié)束生命的過程。這個(gè)現(xiàn)象最早由Carl Vogt發(fā)現(xiàn)的,并將其命名為細(xì)胞凋亡[15]。其形態(tài)學(xué)改變包括細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、核裂解成碎片等。研究表明,活化后的 NF-κB與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系,其參與多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,具有抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的雙向作用[2]。

2.1 NF-κB對細(xì)胞凋亡的抑制作用

NF-κB具有抑制細(xì)胞凋亡的作用最早是在1995年被證實(shí)的,試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)被剔除 RelA基因的胎鼠發(fā)育到 15～16 d時(shí)死亡,并伴隨著肝細(xì)胞的大量凋亡,其機(jī)制是通過腫瘤壞死因子受體 1(tumor necrosis factor receptor1,TNFR1)介導(dǎo)發(fā)揮作用[16]。NF-κB對細(xì)胞凋亡的抑制過程是一個(gè)涉及多個(gè)信號通路的復(fù)雜過程,其主要是通過對下游抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄激活作用來實(shí)現(xiàn)的,這些基因包括 IEX-IL、Bcl-2家族、c-FLIP以及 IAP(inhibitor of apoptosis)家族的 XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2等,其調(diào)節(jié)位點(diǎn)上均有 NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)[17],它們的產(chǎn)物通過作用于細(xì)胞凋亡酶 -3(caspase-3)和線粒體的上游而發(fā)揮作用。例如,在纖維肉瘤細(xì)胞中 ,NF-κB誘導(dǎo) c-IAP-1、c-IAP-2、TNFR1和TNFR2共同表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡酶 -8(caspase-8)活性,阻斷細(xì)胞色素 C釋放,從而抑制細(xì)胞凋亡。眾所周知,細(xì)胞色素 C是 caspase-3激活的促發(fā)因素,是調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。又如 B淋巴細(xì)胞中,CD40誘導(dǎo)的抗凋亡也需要 NF-κB參與,通過上調(diào) Bcl-2、Bcl-X表達(dá)而發(fā)揮作用,如果阻斷 NF-κB的激活就會消除上調(diào)作用而無法起到抗凋亡作用。

隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn) NF-κB的抗細(xì)胞凋亡作用與越來越多的信號途徑有關(guān)。A 20是一種鋅指蛋白,研究表明,NF-κB可以通過調(diào)控 A 20蛋白的表達(dá)影響由 TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程[18]。Gadd45β是一種核蛋白,研究發(fā)現(xiàn),NF-κB是其上游的調(diào)節(jié)因子,可以通過調(diào)節(jié)其表達(dá)來影響激酶(JNK),進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡的過程[19]。

2.2 NF-κB對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用

在對 NF-κB的抗細(xì)胞凋亡作用的研究同時(shí),一些證據(jù)則顯示在不同的刺激因素和特定的細(xì)胞類型中,NF-κB對細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。Baichwal等[20]報(bào)道,人的胚胎腎細(xì)胞系 293在血清撤除時(shí)隨著 NF-κB的活化而發(fā)生細(xì)胞凋亡,NF-κB的負(fù)顯性突變基因已具有同樣的結(jié)果。Dumont等[21]報(bào)道,抑制 NF-κB的活性可以使 T細(xì)胞免于由過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Ivanov等[22]發(fā)現(xiàn),在紫外線誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的過程中 NF-κB的表達(dá)下調(diào),細(xì)胞凋亡也隨之減少。Campbell等[23]則發(fā)現(xiàn),NF-κB是通過抑制抗凋亡基因而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。Chen等[24]在腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡途徑的研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng) RelA過量表達(dá)時(shí),呈現(xiàn)對細(xì)胞凋亡的抑制作用,當(dāng) c-Rel表達(dá)增加時(shí),則呈現(xiàn)對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。由此可見,NF-κB在細(xì)胞凋亡中的雙向作用不僅取決于不同的刺激因素和細(xì)胞類型,也與激活的 NF-κB成員的種類和數(shù)量有關(guān)。

3 細(xì)胞凋亡與宰后肌肉嫩化

動物被屠宰放血后,肌細(xì)胞便失去營養(yǎng)基質(zhì)的供給,血液循環(huán)的終止導(dǎo)致肌細(xì)胞沒有氧氣運(yùn)輸?shù)耐緩?。缺血使?xì)胞酸中毒,缺氧使線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)受抑制,心肌轉(zhuǎn)向糖酵解以尋求能量的補(bǔ)充,糖酵解產(chǎn)生大量乳酸堆積在心肌中引起細(xì)胞內(nèi) H+濃度增高,從而使 Na+/H+交換增強(qiáng),H+流出胞外而 Na+流入胞內(nèi),造成細(xì)胞內(nèi) H+濃度下降,pH升高,Na+超載,繼而引起 Na+/Ca2+交換增加,并引起 Ca2+超載。在這種非常有害的生理?xiàng)l件下,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了凋亡信號,很有可能誘發(fā)肌細(xì)胞強(qiáng)制性死亡。正如 Ouali等[25]推斷,動物宰后應(yīng)該有一個(gè)細(xì)胞凋亡的過程,如圖 1所示。

圖 1 宰后肌肉轉(zhuǎn)化為肉的過程Fig.1 The process ofmuscle transformed tomeat after slaughter

宰后肌肉的成熟嫩化對嫩度的改善主要?dú)w因于對肌肉結(jié)構(gòu)蛋白的有限降解。而大量試驗(yàn)已經(jīng)證明,在細(xì)胞凋亡過程中,一些細(xì)胞凋亡酶參與細(xì)胞骨架和結(jié)構(gòu)蛋白的降解。如 Communal等[26]研究證實(shí)了 caspase-3在體外條件下參與心肌多種骨架蛋白的降解過程。黃明等[27]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)caspase-3的專一抑制劑可以使雞肉樣品的多種骨架蛋白降解受抑制。從微觀角度看,肌肉的成熟嫩化是肌細(xì)胞發(fā)生凋亡進(jìn)而繼發(fā)性壞死的過程,因此,細(xì)胞凋亡與肌肉的成熟嫩化有著密切的關(guān)系。

4 NF-κB在肌肉嫩化機(jī)制研究中的前景

肌肉嫩化機(jī)理學(xué)說有很多種,如肌肉自身成熟機(jī)制的“酶假說”,認(rèn)為鈣蛋白酶(calpain)系統(tǒng)經(jīng)肌質(zhì)網(wǎng)釋放 Ca2+激活后,calpain對細(xì)胞骨架進(jìn)行降解,導(dǎo)致細(xì)胞支撐體系瓦解,從而改善肌肉的嫩度。對此已有報(bào)道研究了不同飼喂方式、不同的飼糧蛋白質(zhì)水平對豬背最長肌鈣蛋白酶抑制蛋白表達(dá)量及嫩度的影響[28-29]。又如外界刺激導(dǎo)致肌肉成熟機(jī)制的理論,認(rèn)為通過一定外界刺激加強(qiáng)肌肉收縮,肌動蛋白細(xì)絲過度插入引起 Z線斷裂,肌原纖維結(jié)構(gòu)松弛,進(jìn)而改善肌肉的嫩度[30]。而目前,國內(nèi)外研究人員均沒有對動物屠宰后骨骼肌細(xì)胞的凋亡在肌肉嫩化中的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

NF-κB廣泛存在于多種組織細(xì)胞中,激活后參與多種因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,與細(xì)胞的凋亡存在密切關(guān)系。研究表明,NF-κB可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡,激發(fā)細(xì)胞凋亡酶家族,降解細(xì)胞骨架蛋白[4]。NF-κB很可能參與了肉的嫩化過程,然而對于 NF-κB的研究大部分停留在人類和動物的疾病防預(yù)及治療方面,在動物肉品質(zhì)上的研究甚少。因此,深入研究二者之間的聯(lián)系,便可以通過對 NF-κB的調(diào)節(jié)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,控制凋亡速率,進(jìn)而可以縮短肌肉的成熟嫩化時(shí)間,調(diào)控和改善肉品質(zhì)。

5 小 結(jié)

NF-κB是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子,以往多限于在免疫細(xì)胞及各種疾病中的研究,在骨骼肌中,其研究剛剛起步。NF-κB在細(xì)胞凋亡中的作用已經(jīng)逐漸明朗,細(xì)胞凋亡與肌肉嫩度的關(guān)聯(lián)性也得到證實(shí),因此,在動物營養(yǎng)領(lǐng)域的研究中,對 NF-κB作用的研究將極具前景。

[1] 李勝杰,胡忠良,郭向瑩,等.細(xì)胞凋亡對肌肉宰后嫩化的貢獻(xiàn)[J].食品工業(yè)科技,2010,4(31)：395-398.

[2] DUTTA J,FAN Y,GUPTA N,et al.Current insights into the regulation of p rogramm ed cell death by NF-kappa B[J].Oncogene,2006,25：6800-6816.

[3] KARIN M.Nuclear factor-kappa B in cancer development and progression[J].Nature,2006,441(7092)：431-436.

[4] 蘇劍東,吳靈飛.NF-κB與細(xì)胞凋亡[J].世界華人消化雜志,2007,15(12)：1411-1416.

[5] GHOSH S,MAY M J,KOPP E B.NF-kappa B and Rel proteins：evolutionarily conserved mediators of immune responses[J].Annual Review Immunology,1998,16：225-260.

[6] HUXFORD T,MALRK S,GHOSH G.Structure and mechanism in NF-kappa B/I kappa B signaling[J].Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology,1999,64：533-540.

[7] PEREIRA S G,OAKLEV F.Nuclear factor-kappa B1：regu lation and function[J].The International Journal of Biochem istry and Cell Bio logy,2008,40(8)：1425-1430.

[8] MALEK S,HUANG D B,HUXFORD T,et al.X-ray crystal structure ofan Ikappa Beta×NF-kappa B p65 homodimer comp lex[J].The Journal o f Bio logical Chem istry,2003,278：23094-23100.

[9] UEDA M,KOKURA S,IMAMOTO E,et al.Blocking o f NF-κB activation enhances the tumor necrosis factorα-induced apoptosis of a human gastric cancer cell line[J].Cancer Letters,2003,193(2)：177-182.

[10] BON IZZIG,KARIN M.The two NF-kappa B activation pathw ay and their role in innate and adaptive immunity[J].Trends in Immunology,2004,25(6)：280-288.

[11] LUO JL,KAMATA H,KARIN M.IKK/NF-kappa B signaling：balancing life and death-a new app roach to cancer therapy[J].The Journal of Clinical Investigation,2005,115：2625-2632.

[12] KARIN M,BEN-NEFINH Y.Phosphorylation meets ubiquitination：the control o f NF-κB activity[J].Annual Review of Immunology,2000,18：62l-663.

[13] SENFTLEBEN U,CAO Y,X IAO G,et al.A ctivation by IKK alpha of a second,evo lutionary conserved,NF-kappa B signaling pathway[J].Science,2001,293(5534)：1495-1499.

[14] ESCARCEGA R O,FUENTES-ALECANDRO S,GATICA A,et al.The transcription factor nuclear factor-kappa B and cancer[J].Clinical Onco logy,2007,19(2)：154-161.

[15] KERR J F,W YLLIE A H,CURRIE A R.Apoptosis：a basic biological phenomenon w ith w ide-ranging im plications in tissue kinetics[J].British of Journal of Cancer,1972,26：239-257.

[16] DOI T S,MATINO M W,TAKAHASHIT,et al.Absence of tum or necrosis factor rescues RelA-deficientm ice from embryonic lethality[J].Proceeding of the National Academy Sciences of the United States of America,1999,96(6)：2994-2999.

[17] VERMEULEN L,VANDEN B W,HAEGEMAN G.Regulation o f NF-kappaB transcriptional activity[J].Cancer Treatment and Research,2006,130：89-102.

[18] MALEWICZ M,ZELLER N,YILMAZ Z B,et al.NF-κB controls the balance betw een Fas and tumor necrosis factor cell death pathways during T cell receptor-induced apop tosis via the exp ression of its target gene A 20[J].The Journalof Biological Chem istry,2003,278：32825-32833.

[19] ZAZZERONI F,PAPA S,ALVAREZ K,et al.Gadd45βmediates the protective effects of CD 40 costimulation against Fas-induced apop tosis[J].Blood,2003,102(9)：3270-3279.

[20] BA ICHW AL R,BAEUERLE A.Apoptosis：activate NF-κB or die?[J].Current Biology,1997,7(2)：94-96.

[21] DUMONT A,HEHNER S P,HOFMANN T G,et al.Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD 95-independent,requires the release o f m itochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappa B[J].Oncogene,1999,18(3)：47-757.

[22] IVANOV V,RONA IZ.P38 p rotects human melanoma cells from UV-induced apoptosis through dow nregu lation of NF-kappa B activity and Fas exp ression[J].Oncogene,2000,19：3003-3012.

[23] CAMPBELL K J,ROCHA S,PERK INS N D.Active repression of antiapoptotic gene expression by RelA(65)NF-kappa B[J].Mo lecular Cell,2004,13(6)：853-865.

[24] CHEN X,KANDASAMY K,STIVASTAVA R K.Differential roles of RelA(65)and c-Rel subunits o f nuclear factor kappa B in tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand signaling[J].Cancer Research,2003,63：1059-1066.

[25] OUALIA,HERRERA-MENDEZC H,COULIS G,et al.Revisiting the conversion of m uscle into meat and the underlying mechanisms[J].Meat Science,2006,74(1)：44-58.

[26] COMMUNAL C,SUMANDEA M,TOMBE P,et al.Functional consequences of caspase activation in cardiac m yocy tes[J].Proceedings o f the National A-cadem y of Sciences of the United States o f America,2002,99(9)：6252-6256.

[27] 黃明,趙蓮,徐幸蓮,等.雞肉在成熟過程中肌原纖維蛋白的降解機(jī)制研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2007(11)：42-46.

[28] 張勇,李方方,朱宇旌,等.日糧不同蛋白質(zhì)水平對豬骨骼肌鈣蛋白酶抑制蛋白和鈣蛋白酶基因表達(dá)及嫩度的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2008,20(3)：360-365.

[29] 張勇,高彥,朱宇旌,等.不同飼喂方式對豬背最長肌鈣蛋白酶抑制蛋白和鈣蛋白酶基因表達(dá)及剪切力的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,22(3)：640-646.

[30] KEMPC,PARR T.Comparison of the relative expression of caspase isoforms in differentporcine skeletalmuscles[J].Meat Science,2006,73：426-431.