陳 寧，覃 霞，朱 樑

1．第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200003;2．中國人民解放軍海軍北海艦隊航空兵萊陽場站衛(wèi)生隊

肝細(xì)胞具有多種功能且代謝旺盛，離體培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞用于毒理學(xué)、藥理學(xué)、生物化學(xué)及致癌作用等研究有許多優(yōu)點。目前，哺乳動物原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于肝細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療與生物人工肝支持系統(tǒng)等方面［1］及其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。肝細(xì)胞在體外能否培養(yǎng)成功，分離技術(shù)至關(guān)重要。常用的分離方法主要有:機械法(包括直接分離法、振蕩法等)和酶法(包括膠原酶消化法、胰蛋白酶消化法)。其中用膠原酶在體內(nèi)灌注肝臟的方法分離大鼠肝細(xì)胞生長良好，并且能獲得高產(chǎn)率的完整細(xì)胞。本實驗對膠原酶灌注法進行一些改進，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)肝臟灌注分離大鼠肝細(xì)胞同樣能獲得高活率、高產(chǎn)率的細(xì)胞，在實驗條件下肝細(xì)胞體外原代培養(yǎng)生長良好。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 選用雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量約180～250 g，購自上海第二軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心。喂飼標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，自由飲水，并按照動物飼養(yǎng)環(huán)境控制參數(shù)調(diào)節(jié)溫度和濕度，12 h晝夜輪回。

1．2 實驗材料與儀器 DMEM-F12培養(yǎng)液(HyClone公司)、胎牛血清(GIBCO公司)、Ⅳ型膠原酶(Sigma公司)、D-hanks液(長征醫(yī)院中心實驗室自行配制)、PAS染色試劑盒(上海源葉公司)、鼠尾膠原(杭州生友公司)、雙抗(GIBCO公司)。恒流泵(HL-2D型，上海青浦滬西儀器廠)、手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械股份有限公司)、超凈工作臺HF-Safe 1500(上海力申科學(xué)儀器有限公司)、CO2培養(yǎng)箱(美國Revco公司)、水平高速低溫離心機5810R(德國Eppendorf公司)、倒置光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)。

1．3 肝細(xì)胞的分離［2-4］取大鼠，乙醚吸入麻醉后，腹腔注射7%的水合氯醛10 min后背位固定大鼠，常規(guī)消毒鋪巾，U形開腹;暴露并游離門靜脈、顯露肝門靜脈2～3 cm，與門靜脈下置兩條4號結(jié)扎線暫不結(jié)扎，穿刺針插入門靜脈后立即結(jié)扎固定，盡快啟動蠕動泵，同時剪斷肝下腔靜脈遠端，用37℃預(yù)溫20 min后的D-Hanks液20～30 mL/min快速經(jīng)門靜脈灌注清除肝內(nèi)血液，30 s內(nèi)即可見肝臟顏色變淺，持續(xù)灌注10 min至肝臟呈米黃色。當(dāng)下腔靜脈中流出的液體變清時，開始灌注經(jīng)37℃預(yù)溫20 min后的消化酶液100 mL(25 mgⅣ型膠原酶)，按照灌流速度為10～20 mL/ min充分消化肝臟10～20 min。直至肝臟表面出現(xiàn)龜裂狀且變軟。停止灌注，小心剪取各肝葉置入消毒平皿內(nèi)，撕碎肝臟并去除纖維結(jié)締組織，將制成的混合肝細(xì)胞懸液分別過100目、200目篩網(wǎng)后，低速離心3次(50×g，3 min)，獲得純化的肝細(xì)胞。

1．4 肝細(xì)胞的原代培養(yǎng) 采用DMEM F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，將活力在90%以上的肝細(xì)胞以(2～5)×105/mL的密度接種于鋪有鼠尾膠2 μg/mL的60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液中加入下列成分以利于肝細(xì)胞的生長，以青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L，胎牛血清20%。每皿中加入4 mL。培養(yǎng)條件為5%CO2的37℃孵箱，穩(wěn)定培養(yǎng)24～36 h后換入新鮮培養(yǎng)液。

1．5 大鼠肝細(xì)胞成活率與形態(tài)學(xué)觀察 新取肝細(xì)胞活細(xì)胞記數(shù)，取經(jīng)3次洗滌后的肝細(xì)胞懸液加入等量臺盼藍染液混合染色數(shù)秒后，滴于玻片，置顯微鏡下行活細(xì)胞記數(shù)。

1．6 倒置顯微鏡下觀察新分肝細(xì)胞形態(tài)

1．7 PAS染色鑒定肝細(xì)胞 待肝細(xì)胞生長成片后，取出蓋片，依次進行0．9%的生理鹽水清洗2次，每次約3 min，70%的酒精固定約10 min。PAS染色，封片，鏡下觀察。

2 結(jié)果

2．1 臺盼藍染色后細(xì)胞計數(shù) 每只體質(zhì)量約200 g的大鼠能成功分離出(1．0～1．5)×108個肝細(xì)胞，低倍鏡下可見活細(xì)胞呈光亮圓形，飽滿，透光度好，胞核清晰，且不被臺盼藍著色，而死細(xì)胞壁皺縮，透光度差，可被臺盼藍染成藍色。本法所取活細(xì)胞率可達90%以上。

2．2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 游離的活肝細(xì)胞呈分散狀，胞體透亮、圓形、具有立體感。胞核較大，2～4 h后細(xì)胞開始貼壁。24 h后生長良好的肝細(xì)胞成島嶼狀或多邊形，集落生長融合成片鋪滿皿底。其中可見有多核的肝細(xì)胞，48 h后有大量肝細(xì)胞貼壁，呈板狀，連接成島嶼(見圖1、圖2)。

2．3 PAS染色鑒定 100倍物鏡下可見肝細(xì)胞胞質(zhì)被染成粉紅色，胞核不染色，400倍物鏡下可見胞質(zhì)中密集粉紅色糖原顆粒，胞核呈空泡狀(見圖3)。

圖1 新分肝細(xì)胞，圓形，未貼壁(200×);圖2 48 h后肝細(xì)胞貼壁，呈板狀，連接成島嶼(200×);圖3 PAS染色后肝細(xì)胞，呈粉紅色(200×)Fig 1 Primary hepatocytes，round，not adherent(200×);Fig 2 They were adherent，plate and formed small clusters of parenchymal cells(200×);Fig 3 Hepatocytes were identified by PAS．They were pink(200×)

3 討論

肝臟作為機體不可缺少的重要代謝器官，一直備受關(guān)注。所以肝細(xì)胞的分離作為一種體外實驗也越來越被重視。原位灌注消化法分離大鼠肝細(xì)胞由Berry等［5］于1969年報道，后經(jīng)Seglen等［6］的改進，包括兩個原位灌注的步驟。本實驗對分離大鼠肝細(xì)胞的步驟進行了細(xì)致的摸索，并進行了一系列改進，分離出的成年大鼠肝細(xì)胞獲得較高的存活率、純度及產(chǎn)率，臺盼藍染色證實大鼠肝細(xì)胞成活率在90%以上。培養(yǎng)過程中肝細(xì)胞生長狀態(tài)良好。通過摸索與實驗我們發(fā)現(xiàn)，大鼠肝細(xì)胞的成功分離與以下因素密切相關(guān):①用體質(zhì)量為180～250 g的年輕SD大鼠分離較好。② 先用乙醚吸入式麻醉大鼠，但要在其未昏迷時腹腔注射水合氯醛。如乙醚吸入麻醉時間過久再注射麻藥易造成麻醉過度從而影響肝細(xì)胞的成功分離。③門靜脈穿刺時針頭延門靜脈的走向穿刺，且穿刺前檢查針頭處有無氣泡，防止造成肝內(nèi)空氣栓塞從而影響灌沖肝的效果。其次進針過深或過淺均對肝臟的灌沖有影響。④消化酶的濃度一般以0．02%～0．03%為宜，濃度過高膠原酶會破壞肝細(xì)胞膜，而濃度過低則對肝臟消化不徹底，均會使分離下來的肝細(xì)胞成活率低。⑤有文獻介紹撕肝后于膠原酶溶液中震蕩15 min，此步驟經(jīng)筆者實驗后發(fā)現(xiàn)對肝細(xì)胞產(chǎn)量影響較大，考慮可能是震蕩過程中膠原酶對肝細(xì)胞消化作用較強會使其變?yōu)榧?xì)胞碎片，從而離心后得到的細(xì)胞產(chǎn)量較少。⑥本研究采用的低速離心(50×g，5 min×3次)可以將肝實質(zhì)細(xì)胞與非實質(zhì)細(xì)胞有效分離開，同時減少對肝細(xì)胞的損害。⑦雖然文獻多介紹24 h換液，但為了避免換液時未貼壁的肝細(xì)胞損失過多，可于36 h再換，或換液時輕輕吸取表面少量培養(yǎng)液后，換入新鮮培養(yǎng)液，在保證提供細(xì)胞足夠養(yǎng)分的同時不會丟失過多活細(xì)胞。⑧選擇含有多種因子的培養(yǎng)液，且加入足夠的血清及營養(yǎng)，在培養(yǎng)時間內(nèi)，注意觀察培養(yǎng)液的顏色，及時添加養(yǎng)料，保證實驗期間肝細(xì)胞的穩(wěn)定及較高的存活率［7-9］。⑨肝細(xì)胞生長條件要求較高，運用含營養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)液對肝細(xì)胞的生長及多邊形態(tài)是有保證的［10］。通過比較應(yīng)用，選用DMEM-F12培養(yǎng)液使肝細(xì)胞的貼壁及形態(tài)優(yōu)于199或1640一類的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

綜上所述，眾多學(xué)者在實際操作過程中不斷總結(jié)經(jīng)驗，分離效果不斷提高。本實驗對傳統(tǒng)肝細(xì)胞分離技術(shù)做些許改進后，步驟簡單，成本低廉，分離出的肝細(xì)胞產(chǎn)率及成活率均較高，為肝細(xì)胞的體外研究奠定了基礎(chǔ)。

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