劉小艷,吳海坤,方炳虎*,袁照紅,楊利軍

(1.廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司,廣東新興527400;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州510642)

恩諾沙星是動物專用的廣譜喹諾酮類抗菌藥物,具有殺菌活性強、體內(nèi)分布廣、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特點,對細菌、支原體均有效,臨床常用于腸炎、肺炎、乳房炎、皮膚及軟組織感染的治療[1]。因恩諾沙星味苦,現(xiàn)研制出恩諾沙星(口服)混懸液以改善豬的適口性以利于治療豬的黃白痢等腸道疾病。本試驗的目的在于研究恩諾沙星(口服)混懸液在豬組織中的殘留消除規(guī)律,為該制劑在豬的臨床使用上提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 選取健康二元雜交豬40頭,公母兼有,體重71.3 kg±4.5 kg。試驗前飼養(yǎng)觀察5 d。本次試驗豬均無異常表現(xiàn),生長狀況良好。

1.1.2 試驗藥品與試劑 恩諾沙星混懸液,含量50 mL/L,批號20090107,由廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司提供。恩諾沙星對照品,含量99.9%,批號H0080306;鹽酸環(huán)丙沙星對照品,含量100.0%,批號H010105,均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。乙腈、甲醇為色譜純試劑,其他試劑為分析純,水符合GB/T6682規(guī)定的二級水。

1.1.3 主要儀器 Agilent1200高效液相色譜系統(tǒng),配備四元梯度泵、自動進樣器、柱恒溫系統(tǒng)、熒光檢測器、色譜工作站,美國安捷倫公司。

1.1.4 主要試液配制 0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液:取850 g/L磷酸3.4 mL,用水稀釋至1 000 mL,攪拌下滴加三乙胺,調(diào)pH至2.4;磷酸鹽緩沖液(用于肌肉、脂肪組織):取磷酸二氫鉀6.8 g,加水使溶解并稀釋至500 mL,調(diào)pH至7.0;磷酸鹽緩沖液(用于肝臟、腎臟組織):取磷酸二氫鉀6.8 g,加水溶解并稀釋至500 mL,pH為4.0～5.0;恩諾沙星、環(huán)丙沙星標準儲備液(1 000 μ g/mL):分別精密稱取恩諾沙星50.05 mg、鹽酸環(huán)丙沙星對照品55.22 mg于50 mL的棕色容量瓶,用甲醇定容至刻度,即成1 000 μ g/mL的恩諾沙星、環(huán)丙沙星標準儲備液,置于4℃冰箱保存,使用期為3個月。

1.2 方法

1.2.1 給藥與采樣 每頭豬按10 mg/kg體重的單次劑量,通過經(jīng)口灌服方式給藥,連續(xù)給藥3 d,每天1次。在停藥后的第0、1、3、5、7、10、14、21天各時間點宰殺5頭豬,分別采取臀部肌肉、肝臟、腎臟和脂肪共4種樣品,樣品采集后立即做好標記、包裝,保存于—20℃冰箱,待測。

1.2.2 組織樣品預(yù)處理 按參考文獻[2]進行。

1.2.2.1 提取 準確稱取2.0 g已勻漿的各組織樣品并分別加磷酸鹽緩沖液10.0 mL,10 000 r/min勻漿1 min。勻漿液振蕩混合5 min,4 000 r/min離心10 min,用磷酸鹽緩沖液10.0 mL沖洗殘渣,振蕩、離心,合并上清液,備用。

1.2.2.2 凈化 C18固相萃取柱依次用2 mL甲醇活化、2 mL磷酸鹽緩沖液潤洗,潤洗完畢后,準確量取5 mL備用液過柱,用2 mL水淋洗,擠干。加1 mL流動相洗脫,擠干,收集洗脫液,搖勻,經(jīng)濾膜過濾后作為試樣溶液,取20 μ L試樣溶液進樣,供高效液相色譜分析。

1.2.3 色譜條件及工作指標 色譜柱:phenomenex luna-C18,4.6 mm×250 mm,5 μ m;流動相:0.05 mol/L磷酸溶液/三乙胺-乙睛(82+18),用前過0.45 μ m濾膜;流速:0.8 mL/min;檢測波長:激發(fā)波長280 nm;發(fā)射波長450 nm;進樣量20 μ L。

1.2.4 各組織標準曲線與線性范圍 準確稱取2.0 g已勻漿的各空白組織置于50 mL離心管中,再加入100 μ L恩諾沙星、環(huán)丙沙星標準系列溶液,渦旋混勻,使得各樣品中恩諾沙星、環(huán)丙沙星濃度為20 μ g/kg～2 000 μ g/kg。按組織樣品預(yù)處理方法處理后,進行HPLC分析,將測得的色譜峰面積(S)與藥物濃度(C)作直線回歸,求得標準曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.5 組織中恩諾沙星、環(huán)丙沙星回收率和變異系數(shù)的測定 準確稱取2 g已勻漿的各空白組織于50 mL離心管中,加入100 μ L不同濃度的混合標準溶液,其中脂肪與肌肉組織添加濃度為50、100、200 μ g/kg,肝臟組織添加濃度為100、200、400 μ g/kg,腎臟組織添加濃度為150、300、600 μ g/kg,渦旋混勻后放置30 min,按“1.2.2”方法處理,計算回收率及變異系數(shù)。

1.2.6 各組織中恩諾沙星與環(huán)丙沙星濃度測定各時間點所采豬組織按“1.2.2”方法處理,進行HPLC分析處理,求得恩諾沙星和環(huán)丙沙星峰面積,按各組織標準曲線方程求得恩諾沙星及環(huán)丙沙星濃度,進而得到各時間點豬各組織中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的殘留含量總和。

1.2.7 休藥期的確定 根據(jù)農(nóng)業(yè)部有關(guān)動物源食品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的最高殘留限量,獲得恩諾沙星混懸液在豬臨床應(yīng)用的休藥期。

2 結(jié)果

2.1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的色譜圖

恩諾沙星、環(huán)丙沙星標準溶液,空白組織、空白添加樣品、連續(xù)給藥后樣品色譜分析圖(圖1～圖4)。

圖1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星標準溶液樣(0.25 μ g/mL)色譜圖Fi g.1 The chromatogram of 0.25 μ g/mL standard solutions of enrofloxacin and ciprofloxacin

圖2 空白肌肉色譜圖Fig.2 The chromatog ram of the blank muscle

圖3 空白肌肉添加恩諾沙星(500 μ g/kg)和環(huán)丙沙星(500 μ g/kg)色譜圖Fig.3 The chromatogram of the blank muscle adding enrofloxacin(500 μ g/kg)and ciprofloxacin(500 μ g/kg)

圖4 肌肉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留色譜圖(1 d) Fig.4 The chromatog ram of enroflox acin and ciprofloxacin of the muscle afer administration 1 d

在以上檢測條件下,能將恩諾沙星、環(huán)丙沙星與組織中的其他組分分開,干擾少。恩諾沙星、環(huán)丙沙星的出峰保留時間分別在9.6 min和7.4 min左右。本次檢測方法最低檢測限為20 μ g/kg,符合殘留檢測需要。

2.2 各組織中恩諾沙星和環(huán)丙沙星測定的標準曲線與線性范圍

2.3 恩諾沙星、環(huán)丙沙星回收率和變異系數(shù)的測定

在20 μ g/kg～2 000 μ g/kg添加濃度下,各組織的回收率為70.0%～90.0%,變異系數(shù)＜10.0%,表明該方法靈敏、準確,具有較好的重現(xiàn)性。

2.4 停藥后豬各組織中恩諾沙星與環(huán)丙沙星殘留測定

豬各組織中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的殘留含量總和結(jié)果見表2。

2.5 休藥期確定

根據(jù)農(nóng)業(yè)部公告[3],恩諾沙星給藥后以恩諾沙星及其主要代謝物環(huán)丙沙星殘留量之和為標志殘留物,規(guī)定在豬各組織中的最高殘留限量(maximum residue limit,MRL):肌肉100 μ g/kg,脂肪100 μ g/kg,肝臟200 μ g/kg,腎臟300 μ g/kg。由本次試驗結(jié)果表明,恩諾沙星混懸液按每頭豬10 mg/kg體重劑量,通過灌服方式進行給藥,連續(xù)使用3 d,以恩諾沙星及其主要代謝物環(huán)丙沙星殘留之和為標示殘留物,殘留在肌肉、脂肪中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星消除較快,第3天總殘留量已下降至檢測限以下;肝和腎臟中的殘留藥物消除較緩慢,第3天腎中藥物總殘留量為185.70 μ g/kg。綜合各組織中總殘留量和MRL規(guī)定,建議恩諾沙星混懸液在豬上的休藥期為5 d。

表1 豬各組織中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的回歸方程與相關(guān)系數(shù)Table 1 Regress linear formulation and relative coefficient of enrofloxacin and ciprofloxacin in pig tissues

表2 各時間點豬組織中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留量Table 2 Residues of enroflxacin and ciprofloxacin in pig tissues in different sampling time

3 討論

恩諾沙星和環(huán)丙沙星在肌肉和脂肪中代謝消除較快、殘留量下降迅速[4-6],這與報道一致。吳海坤等[5]用恩諾沙星混懸液以恩諾沙星計以75 mg/L水給60日齡雞自由飲水,連續(xù)用藥5 d后休藥,休藥第5天,肌肉、肝臟及皮膚+脂肪組織中藥物總殘留量(恩諾沙星+環(huán)丙沙星)分別為(11.12±10.53)、(79.29±28.86)、(50.08±22.09)μ g/kg,而腎臟組織未檢出;休藥第8天,肌肉、腎臟、肝臟組織中均未檢出恩諾沙星及環(huán)丙沙星,皮膚+脂肪的總殘留量為13.84 μ g/kg±10.82 μ g/kg;羅雅勁等[6]用恩諾沙星微囊按以恩諾沙星計以200 g/t飼料給豬混飼,連續(xù)給藥7 d,停藥后第5天,在肌肉、脂肪中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星消除較快,第5天總殘留量已下降至檢測限以下;肝和腎臟中的殘留藥物消除較緩慢,第7天腎中藥物總殘留量為91.48 μ g/kg確定恩諾沙星微囊制劑休藥期為7 d。本次試驗與以上參考文獻結(jié)果存在差異,可能與使用的動物、給藥方式、藥物的劑型有很大關(guān)系,本研究為以后恩諾沙星新劑型的開發(fā)提供了一定的基礎(chǔ)。

[1] 劉小艷,方炳虎,楊利軍,等.恩諾沙星口服混懸液的研制及其對仔豬黃白痢療的效觀察[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2009,30(9):120-122.

[2] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第236號.動物性食品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星殘留檢測方法-高效液相色譜法[S].2003.

[3] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號.動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].2002.

[4] 仲 鋒,郭筱華,黃齊頤,等.恩諾沙星在豬組織中殘留消除規(guī)律研究[J].中國獸藥雜志,2005(2):6-9.

[5] 吳海坤,方炳虎,時書寧,等.恩諾沙星混懸液的研制及其在雞組織中的殘留研究[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2010,31(4):47-52.

[6] 羅雅勁,孫永學(xué),李小娜,等.恩諾沙星微囊制劑在豬體內(nèi)殘留消除規(guī)律研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37(2):129-131.