胡天覺(jué),吳娟娟,曾光明,劉 暉,張 瀅,黃丹蓮,余 冰,沈瑩

(1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410082;

2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長(zhǎng)沙 410082)

簡(jiǎn)青霉對(duì)酚類(lèi)和苯胺類(lèi)污染物的降解研究*

胡天覺(jué)?,吳娟娟,曾光明,劉 暉,張 瀅,黃丹蓮,余 冰,沈瑩

(1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410082;

2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長(zhǎng)沙 410082)

在培養(yǎng)4 d的簡(jiǎn)青霉培養(yǎng)體系中,分別加入不同濃度的酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì),觀察這些有毒物質(zhì)對(duì)簡(jiǎn)青霉生長(zhǎng)的影響,并研究簡(jiǎn)青霉對(duì)這幾種有毒物質(zhì)的降解效果.結(jié)果表明:低濃度的酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)能促進(jìn)簡(jiǎn)青霉的生長(zhǎng),高濃度的這些物質(zhì)則對(duì)簡(jiǎn)青霉的生長(zhǎng)有一定的抑制作用.同時(shí)簡(jiǎn)青霉能夠很好地催化氧化苯酚,2,4-二氯苯酚和苯胺.當(dāng)苯酚質(zhì)量濃度為500μg/ m L,2,4-二氯苯酚質(zhì)量濃度為50μg/m L,苯胺的質(zhì)量濃度為1 000μg/m L時(shí),簡(jiǎn)青霉對(duì)這三者的降解率都接近100%.在2,4-二氯苯酚質(zhì)量濃度為60～125μg/m L,苯胺質(zhì)量濃度為2 000～5 000 μg/m L時(shí),簡(jiǎn)青霉對(duì)它們的降解率分別達(dá)到60%和70%以上.簡(jiǎn)青霉對(duì)對(duì)硝基苯酚和對(duì)硝基苯胺降解效果不明顯,在研究的濃度范圍內(nèi),簡(jiǎn)青霉對(duì)它們的降解率只在10%左右.

苯胺類(lèi)化合物;簡(jiǎn)青霉;酚類(lèi)化合物;生物降解

酚類(lèi)化合物主要來(lái)源于煤氣廠、石油化工廠和制藥廠等,是重要的化工原料和中間體[1].苯胺類(lèi)物質(zhì)是制藥、殺蟲(chóng)劑、除草劑和染料等工業(yè)制備中重要的化工原料[2].由于它們對(duì)生物有機(jī)體的毒性作用,以及大多數(shù)難以生物降解,已被美國(guó)EPA列為優(yōu)先控制的污染物,在我國(guó)也被列為“水中優(yōu)先控制污染物”[2-3].

目前酚類(lèi)和苯胺類(lèi)化合物的降解方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法.與物理法和化學(xué)法相比,生物法具有成本低,效率高,反應(yīng)條件溫和以及無(wú)2次污染等優(yōu)點(diǎn).目前,在對(duì)微生物降解酚類(lèi)和苯胺類(lèi)化合物的研究中,大多數(shù)為細(xì)菌降解,如:惡臭假單胞菌、產(chǎn)堿桿菌、不動(dòng)桿菌和紅球菌降解等[4-5].而細(xì)菌的生長(zhǎng)容易受有機(jī)物濃度,廢水的pH值等因素的影響,尤其對(duì)重金屬很敏感.與細(xì)菌相比,真菌對(duì)有毒污染物具有較強(qiáng)的忍耐性和解毒作用.在酚類(lèi)和苯胺類(lèi)的污染中常伴隨著其它各種有害物質(zhì)的污染,因此利用真菌處理含酚廢水和含苯胺類(lèi)廢水具有很大的應(yīng)用潛力.

本文研究簡(jiǎn)青霉真菌對(duì)酚類(lèi)和苯胺類(lèi)污染物的降解,為難降解有機(jī)物的生物降解提供研究基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

無(wú)菌操作室,高壓蒸汽滅菌鍋,恒溫振蕩培養(yǎng)箱,濁度儀,離心機(jī),UV-2550紫外分光光度計(jì).

1.2 菌種和培養(yǎng)基

簡(jiǎn)青霉由湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院863課題研究組提供.

固體培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):葡萄糖20 g,瓊脂15 g,去皮土豆200 g,蒸餾水1 000 m L.

液體培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,NH4 Cl2.0 g,MgSO4?7H2O 0.5 g,KH2PO41.0 g,Na2HPO4?12H2O 0.504 g,MnSO4?H2O 0.039 g,CuSO4?5H2O 0.007 g,FeSO4?7H2O 0.007 g,蒸餾水1 000m L.

1.3 降解體系的建立

250 m L的錐形瓶中裝入100m L的液體培養(yǎng)基(即100/250m L的培養(yǎng)體系),在滅菌后的培養(yǎng)體系中無(wú)菌接入107個(gè)/m L的孢子懸浮液2 m L,于30℃,140 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng).4 d后在培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì),繼續(xù)振蕩培養(yǎng).每組實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)平行樣.有機(jī)物濃度的選擇根據(jù)文獻(xiàn)[6-10]確定.

1.4 降解率的測(cè)定

在振蕩培養(yǎng)4 d后的100/250 m L的培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì),以未加這些物質(zhì)的培養(yǎng)體系為對(duì)照樣,取適量菌液,6 000 r/m in離心15m in,過(guò)濾,取上清液,測(cè)初始濃度.繼續(xù)培養(yǎng),同樣方法分別測(cè)7 d后和10 d后的有機(jī)物濃度.最后結(jié)果用對(duì)照樣的菌液吸光度加以校正,計(jì)算降解率.

酚類(lèi)化合物采用4-氨基氨替比啉法測(cè)定,苯胺類(lèi)化合物采用萘乙二胺偶氮光度法測(cè)定[11].

1.5 漆酶活性測(cè)定

以ABTS為底物,反應(yīng)總體積為3 m L.取2.0 m L 0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH= 5.0),加入0.5 m L 5 mmol/L的ABTS和0.5 m L的粗酶液,混合于30℃水浴中反應(yīng)3 min,迅速測(cè)定OD420值.每個(gè)樣品重復(fù)做3次,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%.對(duì)照組以同等體積的緩沖液代替粗酶液.酶活力單位(U)為:每分鐘催化1 m ol ABTS氧化所需的酶量.

粗酶液的制取:取一定量培養(yǎng)液,6 000 r/min離心15 min,再經(jīng)過(guò)孔徑為0.22 m的濾膜過(guò)濾.

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)對(duì)簡(jiǎn)青霉生長(zhǎng)的影響

2.1.1 酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)對(duì)簡(jiǎn)青霉形態(tài)的影響

在振蕩培養(yǎng)條件下,簡(jiǎn)青霉呈球狀生長(zhǎng),培養(yǎng)2 d后,菌球較小,4 d后菌球的直徑為3～4mm,生長(zhǎng)較均勻,菌液呈微紅色.繼續(xù)培養(yǎng),10 d后菌球的直徑為5mm,并且菌球表面產(chǎn)生倒刺,如圖1所示.

圖1 對(duì)照樣的簡(jiǎn)青霉形態(tài)Fig.1 Themorphology of Penicillium sim p licissimum cu ltured w ithout adding toxic substances

加入苯胺和對(duì)硝基苯胺后,菌液體系的顏色分別如圖2和圖3所示.在苯胺質(zhì)量濃度為4 000和5 000μg/m L時(shí),菌液呈褐色,且后者比前者的菌液顏色更深,其它濃度的菌液呈土黃色.當(dāng)加入不同濃度對(duì)硝基苯胺時(shí),各濃度體系中均有少量的黃色絮狀沉淀.繼續(xù)培養(yǎng),沉淀溶解,菌液顏色呈黃色,對(duì)硝基苯胺的濃度越高,菌液的顏色越深,且菌球也呈黃色,這是因?yàn)榫驅(qū)?duì)硝基苯胺有一定的吸附作用.加入苯酚、對(duì)硝基苯酚、2,4-二氯苯酚后菌液的顏色還是呈微紅色,與對(duì)照樣相比,未發(fā)現(xiàn)有明顯的變化.

圖2 苯胺質(zhì)量濃度依次為1 000,2 000,3 000, 4 000和5 000μg/m L條件下培養(yǎng)的簡(jiǎn)青霉形態(tài)Fig.2 Themorphology of Penicillium simp licissimum cu ltured w ith aniline at the concentration o f 1 000, 2 000,3 000,4 000,5 000μg/m L respectively

圖3 對(duì)硝基苯胺質(zhì)量濃度依次為50,100, 150和200μg/m L條件下培養(yǎng)的簡(jiǎn)青霉形態(tài)Fig.3 Themorphology of Penicil lium simp licissimum cu ltured with p-nitroanilineat the concentration of 50,100,150,200μg/m L respectively

2.1.2 酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)對(duì)菌球直徑的影響

培養(yǎng)10 d后的降解體系,在不同濃度酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)作用下簡(jiǎn)青霉的菌球直徑如表1所示.

表1 不同濃度酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)作用下簡(jiǎn)青霉菌球直徑Tab.1 The sphere diameter of Penicillium simp licissimum under different concentration of phenols and anilines

低濃度的有機(jī)物對(duì)簡(jiǎn)青霉的生長(zhǎng)影響不大,與對(duì)照樣中的菌球直徑相比,沒(méi)有明顯變化,菌球直徑都在5mm左右.有機(jī)物對(duì)簡(jiǎn)青霉的毒性作用隨著有機(jī)物本身濃度的增加而增大,菌球直徑則隨有機(jī)物濃度的增加而減小.簡(jiǎn)青霉在高濃度有機(jī)物作用下,菌球直徑是3～4 mm,當(dāng)苯胺的質(zhì)量濃度為4 000,5 000μg/m L時(shí),簡(jiǎn)青霉的菌球直徑最小,為2～3 mm.

2.1.3 酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)對(duì)簡(jiǎn)青霉生物量的影響

培養(yǎng)10 d后的降解體系經(jīng)6 000 r/min的離心機(jī)離心15m in后,過(guò)濾,菌體烘干至恒重,稱(chēng)重,測(cè)量不同濃度酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)作用下簡(jiǎn)青霉的生物量.

由表2可以看出,與對(duì)照樣中的簡(jiǎn)青霉生物量相比,在低濃度有機(jī)物的作用下,簡(jiǎn)青霉的生物量有一定的增加,當(dāng)有機(jī)物的濃度逐漸增大時(shí),簡(jiǎn)青霉的生物量則明顯減少.

表2 不同濃度酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)作用下簡(jiǎn)青霉生物量Tab.2 The biomass of Penicillium sim plicissimum under different concentration of phenols and anilines

2.2 液體培養(yǎng)條件下簡(jiǎn)青霉的漆酶活性

在培養(yǎng)4 d后的體系中,分別加入苯酚、對(duì)硝基苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺和對(duì)硝基苯胺,使它們?cè)诰后w系中的質(zhì)量濃度分別為500,50,25,1 000和25μg/m L,每天取樣測(cè)酶活性,對(duì)照樣則在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)每天取樣測(cè)酶活性.液體培養(yǎng)條件下的漆酶活性隨時(shí)間的變化如圖4所示.

圖4 液體培養(yǎng)條件下簡(jiǎn)青霉漆酶活性Fig.4 Laccase activities o f Penicillium sim p licissimum in liquid cu ltivation

在培養(yǎng)的初始階段,漆酶的活性很低,幾乎接近零.隨著時(shí)間的增加,酶活性緩慢上升.在培養(yǎng)4～7 d時(shí),酶活性明顯增加,且變化率要大于培養(yǎng)8～10 d時(shí)的上升率.培養(yǎng)4 d后,加入酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì),漆酶的活性隨時(shí)間的變化趨勢(shì)和對(duì)照樣是一致的,只是在數(shù)值上有些微差異.剛加入污染物,漆酶活性相比于對(duì)照樣略有上升,在培養(yǎng)的后幾天漆酶活性與對(duì)照樣酶活性基本維持在一個(gè)水平.

2.3 簡(jiǎn)青霉對(duì)幾種酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)的降解

簡(jiǎn)青霉對(duì)酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)的降解如圖5所示.

簡(jiǎn)青霉對(duì)酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)的降解率隨酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量濃度的增加逐漸減小.

簡(jiǎn)青霉對(duì)苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺的降解效果較好.當(dāng)苯酚的質(zhì)量濃度在500μg/m L左右時(shí), 10 d后的降解率高達(dá)100%.當(dāng)2,4-二氯苯酚的質(zhì)量濃度為50μg/m L時(shí),降解率達(dá)到100%,隨著2,4-二氯苯酚濃度增加至90μg/m L時(shí),10 d后簡(jiǎn)青霉對(duì)它的降解率減少至60%,且在一定的濃度范圍內(nèi),降解率均保持在60%以上.當(dāng)苯胺的質(zhì)量濃度為1 000,2 000μg/m L時(shí),簡(jiǎn)青霉對(duì)它的降解率高達(dá)80%以上,質(zhì)量濃度為3 000,40 000和5 000 μg/m L時(shí),簡(jiǎn)青霉對(duì)它的降解率均在60%左右.

簡(jiǎn)青霉對(duì)對(duì)硝基苯酚和對(duì)硝基苯胺很難降解,當(dāng)對(duì)硝基苯酚質(zhì)量濃度為25μg/m L時(shí),降解率只有15%左右,在研究的濃度范圍內(nèi)簡(jiǎn)青霉對(duì)對(duì)硝基苯酚的降解率均低于15%.當(dāng)對(duì)硝基苯胺質(zhì)量濃度為25μg/m L時(shí),降解率達(dá)到13%左右.可見(jiàn)簡(jiǎn)青霉對(duì)對(duì)硝基苯酚和對(duì)硝基苯胺很難降解.

圖5 7 d和10 d后不同濃度酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)的降解效果Fig.5 The degradation rate o f phenols and anilines in different concentrations by Penicil lium simp licissimum after 7 and 10 days

2.4 酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)降解隨時(shí)間的變化關(guān)系

在培養(yǎng)4 d后的體系中,分別加入苯酚、對(duì)硝基苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺和對(duì)硝基苯胺,使其在菌液體系中的質(zhì)量濃度分別為500,60,25,1 000, 25μg/m L.每天定時(shí)取樣.簡(jiǎn)青霉對(duì)酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)的降解隨時(shí)間的變化關(guān)系如圖6所示.

圖6 酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)的降解隨時(shí)間的變化關(guān)系Fig.6 The degradation rate of pheno ls and anilines in the variation of time

簡(jiǎn)青霉對(duì)苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺有很好的降解作用,在培養(yǎng)5～7 d時(shí),簡(jiǎn)青霉對(duì)它們的降解作用比較明顯,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,降解率的增幅逐漸減小.而簡(jiǎn)青霉對(duì)對(duì)硝基苯酚和對(duì)硝基苯胺較難降解,培養(yǎng)10 d后,降解率均低于20%.而且在降解的前幾天,簡(jiǎn)青霉對(duì)它們基本上沒(méi)有降解.隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,降解率緩慢增加.

2.5 分析

在培養(yǎng)的初始階段,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比較充足,簡(jiǎn)青霉大量生長(zhǎng),當(dāng)培養(yǎng)4 d以后,簡(jiǎn)青霉的菌球直徑達(dá)到3～4 mm,菌球數(shù)量較多,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也被大量消耗, C,N源短缺,從而促進(jìn)漆酶的分泌.所以從圖4中可以看到,培養(yǎng)4 d以后漆酶活性較培養(yǎng)初期有大幅提高.培養(yǎng)7 d以后,漆酶仍呈增加的趨勢(shì),只是增幅較前一階段有所下降.這與酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)隨時(shí)間的降解情況是一致的(圖6).這說(shuō)明,酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)的降解與簡(jiǎn)青霉漆酶活性有一定的關(guān)系,降解率隨漆酶活性的增加而增大.

低濃度的酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)對(duì)簡(jiǎn)青霉的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用,這是因?yàn)榈蜐舛鹊挠袡C(jī)物為簡(jiǎn)青霉補(bǔ)充了一定的C,N源,促進(jìn)了簡(jiǎn)青霉的生長(zhǎng),所以在低濃度的有機(jī)物作用下,簡(jiǎn)青霉的生物量比對(duì)照樣中多,分泌的漆酶活性相比對(duì)照樣中的漆酶活性也要略高一點(diǎn).當(dāng)酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)濃度逐漸增加,它們對(duì)簡(jiǎn)青霉的毒性逐漸增強(qiáng),簡(jiǎn)青霉的生物量和菌球直徑均低于對(duì)照樣中的值(表1,表2).說(shuō)明高濃度的有毒物質(zhì)對(duì)簡(jiǎn)青霉的生長(zhǎng)有抑制作用.

從簡(jiǎn)青霉對(duì)不同濃度酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)的降解情況可以看出,簡(jiǎn)青霉對(duì)低濃度有機(jī)物降解率高于對(duì)高濃度有機(jī)物的降解率,這可能是因?yàn)?首先,低濃度的有機(jī)物能成為簡(jiǎn)青霉的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),促進(jìn)簡(jiǎn)青霉的生長(zhǎng),簡(jiǎn)青霉的菌體數(shù)量增加,在代謝過(guò)程中分泌的漆酶較多;其次,有機(jī)物本身對(duì)簡(jiǎn)青霉有一定的毒害作用,當(dāng)濃度很高時(shí)則會(huì)抑制簡(jiǎn)青霉的生長(zhǎng),影響簡(jiǎn)青霉的代謝.簡(jiǎn)青霉能較好地降解苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺,而對(duì)對(duì)硝基苯酚和對(duì)硝基苯胺較難降解,這可能與對(duì)硝基苯酚和對(duì)硝基苯胺中的硝基有一定的關(guān)系.

3 結(jié) 論

1)低濃度酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)對(duì)簡(jiǎn)青霉生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,高濃度時(shí)對(duì)簡(jiǎn)青霉生長(zhǎng)有一定的抑制作用.

2)簡(jiǎn)青霉對(duì)酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)的降解隨時(shí)間的變化,與漆酶活性隨時(shí)間的變化規(guī)律一致.說(shuō)明酚類(lèi)和苯胺類(lèi)物質(zhì)的降解與簡(jiǎn)青霉分泌漆酶有關(guān).

3)簡(jiǎn)青霉對(duì)苯酚、2,4-二氯苯酚、苯胺都有很好的降解能力,而對(duì)對(duì)硝基苯胺和對(duì)硝基苯酚的降解效果較差,這說(shuō)明帶硝基的苯環(huán)物質(zhì)比不帶硝基的苯環(huán)物質(zhì)更難被簡(jiǎn)青霉降解.

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Research on the Degradation Effect of Contaminants like Phenols and Anilines by Using Penicillium sim p licissimum

HU Tian-jue?,WU Juan-juan,ZENG Guang-ming,LIU H ui,ZHANG Ying, HUANG Dan-lian,YU Bing,SHEN Ying

(1.College of Environmental Science and Engineering,Hunan Univ,Changsha,Hunan 410082,China;2.Key Laboratory of
Environmental Biology and Pollution Control(Hunan Univ),Ministry of Education,Changsha,Hunan410082,China)

In order to study the grow th of Penicillium simp licissimum exposed to phenolsand anilines, and the deg radation of these toxic substances,several different concentrations of phenols and anilinesw ere added to the culture system,which was cultured for 4 daysw ith Penicillium sim p licissimum.The results have show n that low concentrations of pheno ls and anilines can p rom ote the grow th of Penicillium sim p licissimum,But on the contrary,the grow thw ould be restrained under the culture of high concentrations.M eanwhile,Penicillium sim p licissim um can catalyze and oxidize phenol,2,4-dich lorophenol and aniline effectively.When the concentration of phenol was controlled at 500μg/m L,2,4-dichlorophenol was 50μg/m L,and anilinew as1 000μg/m L,the degradation rates of phenol,2,4-dichlorophenoland anilinewere all close to 100%.When the concentration of 2,4-dichlorophenolwas controlled at 60～125μg/ m L and anilinew as 2 000～5 000μg/m L,the degradation rates were over 60%and 70%,respectively. However,the degradation effect of p-nitrophenol and p-nitroaniline by Penicillium sim p licissimum was worse,and their degradation rate was only about 10%.

phenolic compounds;Penicillium simp licissimum;aniline compounds;biological degradation

Q89

A

1674-2974(2011)04-0061-05 *

2010-05-07

湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(07JJ5053)

胡天覺(jué)(1966-),男,湖南長(zhǎng)沙人,湖南大學(xué)副教授,博士

?通訊聯(lián)系人,E-mail:hutj66@yahoo.com.cn.