于柏峰,谷海瀛,趙振東,翟英超

（海南省人民醫(yī)院輸血科,海口 570311）

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa,PA）是引起人類感染的傳統(tǒng)致病菌,也是醫(yī)院內(nèi)呼吸道感染的常見病原菌之一。由其引起的感染具有難治性、高耐藥性和高病死率的特點(diǎn),在院內(nèi)感染和臨床抗感染治療中占有極其重要的地位[1]。感染后引發(fā)炎性反應(yīng),在炎性反應(yīng)的基礎(chǔ)上,會(huì)引起一定程度的肺纖維化[2]。本研究應(yīng)用PA引起的慢性呼吸道感染的鼠動(dòng)物模型,通過檢測(cè)其肺泡灌注液中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）,白細(xì)胞介素8（IL-8）以及血清中核基質(zhì)蛋白-2（MMP-2）濃度變化,對(duì)由其引起的炎性反應(yīng)及肺纖維化程度進(jìn)行研究,為由該菌引起疾病的診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 6～8周齡雄性昆明小鼠（清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn),體質(zhì)量26～32g）由海南省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心負(fù)責(zé)飼養(yǎng),所有的小鼠處于自然活動(dòng)狀態(tài)。IL-1β、IL-8及M MP-2檢測(cè)試劑盒由美國(guó)R＆D Systems公司提供。

1.2 菌株配制[3]將標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)A27853（來自于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院菌種保藏中心）接種到血平板,選取經(jīng)過對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的標(biāo)準(zhǔn)菌株27853單個(gè)菌落接種到2mL TSB中,37℃、18h擴(kuò)增。菌液濃度用10倍稀釋的TSB瓊脂培養(yǎng)基評(píng)估。用麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?相當(dāng)于 0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬ù蠹s 1.3×108CFU/mL）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組情況 將55只小鼠分為3組：A組25只,經(jīng)支氣管接種無菌瓊脂糖珠懸液50μ L；B組25只,經(jīng)支氣管接種富含PA瓊脂糖珠懸液50μ L；C組5只,不接種,作為健康對(duì)照組。

1.4 感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠氣管切開,分別注入50μ L有PA或無菌瓊脂糖珠懸液。立即豎起小鼠,保持2min,使菌液流下進(jìn)入肺內(nèi),小鼠有類似嗆咳反應(yīng)。切開傷口不做處理,自然愈合。對(duì)照組小鼠只做切口不接種。

1.5 標(biāo)本的采集及處理 分別于接種后1、2、3、5、7d用10%乙醚麻醉小鼠后,先經(jīng)心臟取血,血清標(biāo)本收集貯存于-80℃冰箱中用于MMP-2及IL-1β、IL-8濃度檢測(cè)。用7號(hào)有斜面的靜脈采血針進(jìn)行肺泡灌注,分3次,每次灌注1.0mL無菌PBS,收集回收液,總回收液要大于2mL,用于IL-1β、IL-8濃度檢測(cè)

1.6 標(biāo)本檢測(cè) 應(yīng)用酶聯(lián)免疫定量技術(shù)檢測(cè)IL-1β、IL-8及MMP-2,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用Excel及SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示,每組不同時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的差異用方差分析處理,各檢測(cè)指標(biāo)峰值間差異用方差分析處理,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β、IL-8濃度 B組比C組中炎性介質(zhì)濃度明顯升高,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而A組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。IL-1β、IL-8濃度在接種PA（B組）2～3d肺泡灌洗液中濃度達(dá)到高峰,與接種無菌瓊脂（A組）肺泡灌洗液中炎性介質(zhì)峰值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩種細(xì)胞因子在接種7d后接近正常水平。血清中未檢測(cè)到IL-1β及IL-8,僅有極少數(shù)小鼠有低水平表達(dá)（數(shù)據(jù)未顯示）,見表1、2。2.2 血清中MMP-2濃度 B組血清中M MP-2峰值與A組峰值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,而A組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。B組M MP-2濃度在第3天達(dá)峰值,見表3。

表1 小鼠肺泡灌注液中l(wèi)L-1β濃度（±s）

表1 小鼠肺泡灌注液中l(wèi)L-1β濃度（±s）

△：P＜0.05,與C組比較；*：P＜0.05,與A組峰值比較。-：表示無數(shù)據(jù)。

取樣時(shí)間（d）A組n IL-1β（ng/mL）B組n IL-1β（ng/mL）C組n IL-1β（ng/mL）1 4 75.5±21.3 4 555.4±5.9 5 62.5±13.42 5 97.0±10.7△5 105.7±23.9 - -3 5 59.3±11.3 5 122.3±29.2*△- -5 4 61.4±14.9 3 94.4±11.0 - -7 3 58.9±11.5 4 77.9±6.5 - -

表2 小鼠肺泡灌注液中IL-8濃度（±s）

表2 小鼠肺泡灌注液中IL-8濃度（±s）

△：P＜0.05,與C組比較；*：P＜0.05,與A組峰值比較。-：表示無數(shù)據(jù)。

取樣時(shí)間（d）A組n IL-8（ng/mL）B組n IL-8（ng/mL）C組n IL-8（ng/mL）1 4 23.4±6.1 4 26.3±4.6 5 20.9±5.82 5 18.6±2.7 5 88.2±14.1△- -3 5 17.7±6.3 5 89.6±15.2*△ - -5 4 17.4±4.8 3 26.9±8.4 - -7 3 17.8±3.1 4 21.2±10.6 - -

表3 小鼠血清中MM P-2濃度（±s）

表3 小鼠血清中MM P-2濃度（±s）

△：P＜0.05,與C組比較；*：P＜0.05,與A組峰值比較。-：表示無數(shù)據(jù)。

取樣時(shí)間（d）A組n MMP-2（ng/mL）B組n MMP-2（ng/mL）C組nMMP-2（ng/mL）1 4 8.4±1.6 4 8.7±1.6 5 8.9±2.42 5 9.4±2.4 5 18.2±5.2 - -3 5 9.9±5.4 5 21.7±11.7*△ - -5 4 6.2±0.76 3 8.6±1.6 - -7 3 7.1±1.4 4 7.9±2.6 - -

3 討論

炎癥是機(jī)體對(duì)外來刺激產(chǎn)生的一種病理反應(yīng)過程,IL-1β、IL-8等是已知的各種炎性反應(yīng)的起始[4],它們可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集、活化和炎癥介質(zhì)的釋放[5],并具有趨化作用,產(chǎn)生炎性反應(yīng)。IL-1β可直接作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞,引起發(fā)熱,增強(qiáng)炎性反應(yīng),促進(jìn)機(jī)體對(duì)外來異物的清除；IL-8也可使中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞粘連,使急性炎性反應(yīng)增強(qiáng)。本研究證實(shí)，PA引起的肺部炎性反應(yīng)使肺泡灌注液中IL-1β、IL-8在感染后迅速增加,在2～3d達(dá)到峰值,5～7d恢復(fù)正常。

在本實(shí)驗(yàn)中,兩組小鼠血清中均未檢測(cè)到IL-1β、IL-8,分析原因可能是血中濃度太低,另外因?yàn)槊嘎?lián)免疫法只能檢測(cè)游離的細(xì)胞因子,對(duì)結(jié)合至細(xì)胞或受體的細(xì)胞因子不能測(cè)出；也可能與本實(shí)驗(yàn)采用方法的靈敏度、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的炎性反應(yīng)水平在閾值以下有關(guān)。這與Brown等[6]報(bào)道相同,因?yàn)閺男盘?hào)功能上看,雖然細(xì)胞因子很像內(nèi)分泌激素,但細(xì)胞因子大多數(shù)是釋放在細(xì)胞周圍短距離傳遞信號(hào),而內(nèi)分泌是分泌至血液遠(yuǎn)距離傳遞,這些分泌在局部的細(xì)胞因子常常不能在血中測(cè)出其濃度。但Matthys和Billiau[7]在1997年指出,惡病質(zhì)很少歸因于一種細(xì)胞因子單獨(dú)作用,而是多組細(xì)胞因子的共同作用。他們認(rèn)為,即使某種獨(dú)立的細(xì)胞因子在系統(tǒng)中未被檢測(cè)到,但它已經(jīng)有足夠的數(shù)量充當(dāng)增效劑引起炎性反應(yīng)。

致病性PA感染容易導(dǎo)致肺纖維化,從而導(dǎo)致微循環(huán)系統(tǒng)的阻斷和損傷[5],進(jìn)而引起患者肺部更嚴(yán)重的感染[8]。蛋白酶和抗蛋白酶的失衡是肺氣腫形成的機(jī)制之一[9]；肺纖維化另一個(gè)主要原因是基底膜的降解,而金屬基質(zhì)蛋白酶（MM Ps）幾乎能降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。目前,有學(xué)者認(rèn)為除了中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶外,MMPs家族在肺纖維化中起的重要作用不可忽視[10]。

MMPs是一組具有相同功能、結(jié)構(gòu)高度同源、依賴鋅離子的肽鏈內(nèi)切酶的總稱,MMPs在轉(zhuǎn)錄、分泌、激活和活化后等水平上受到嚴(yán)格調(diào)控。其中MM P-2主要表達(dá)于肺泡巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞,MMP-2能溶解基底膜中Ⅳ型膠原、明膠、層粘蛋白和ECM,導(dǎo)致肺纖維化。有實(shí)驗(yàn)證實(shí),檢測(cè)MMP-2可觀測(cè)肺纖維化的進(jìn)展程度[11]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了動(dòng)物模型血清中MM P-2濃度,觀察由PA感染引起的肺部炎癥變化及肺纖維化的進(jìn)展程度。

通過檢測(cè)動(dòng)物模型肺泡灌注液 lL-1β、IL-8及血清中MMP-2濃度變化,證實(shí)由PA慢性感染引起的炎性反應(yīng)在2～3d達(dá)到峰值,并在肺部炎癥基礎(chǔ)上引起肺部一定程度的囊性纖維化,與相關(guān)研究[12]及臨床進(jìn)程相符,為臨床診斷、治療及該菌的致病性研究提供了依據(jù)。

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