喬磊，崔艷華，曲曉軍

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；2.黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所，哈爾濱 150010）

乳酸菌的適酸性調(diào)節(jié)

喬磊1，崔艷華1，曲曉軍2

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；2.黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所，哈爾濱 150010）

探討了乳酸菌適酸機制有助于抗酸菌株的篩選、發(fā)酵過程中工序的優(yōu)化以及培養(yǎng)基的優(yōu)化等，進而大大提升發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)。對質(zhì)子泵、產(chǎn)堿、細(xì)胞膜變化、大分子保護修復(fù)以及耐酸調(diào)節(jié)在內(nèi)的適酸性調(diào)節(jié)機制進行了一一闡述。

乳酸菌；質(zhì)子泵；適酸性；調(diào)節(jié)

0 引 言

乳酸菌是能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的一類革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱。部分乳酸菌為人體內(nèi)必不可少的具有重要生理功能的益生菌。同時乳酸菌還廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè)。

發(fā)酵過程中由于產(chǎn)生乳酸，生存環(huán)境的pH值會從初始的6.6到6.8降到4.2左右[1]。另外，在人的胃腸道中產(chǎn)生有益作用的乳酸菌，也會面臨胃液中的低pH環(huán)境。在這種低酸度的不利環(huán)境中，大多數(shù)微生物都會腐敗裂解死亡。而乳酸菌卻能生存，表明乳酸菌具有較強適酸能力。那么，乳酸菌是如何進行適酸性調(diào)節(jié)進而生存下來的呢？研究證明，乳酸菌耐酸性調(diào)節(jié)過程中涉及質(zhì)子泵、細(xì)胞膜組成變化、DNA損傷修復(fù)、蛋白質(zhì)損傷修復(fù)以及調(diào)節(jié)子調(diào)控等復(fù)雜過程。乳酸菌的耐酸性調(diào)節(jié)在不同類別的菌群中也存在差異。

1 質(zhì)子泵

該途徑通過去羧基反應(yīng)產(chǎn)生ATP轉(zhuǎn)運和消耗胞質(zhì)內(nèi)的H+，從而提高細(xì)胞質(zhì)環(huán)境的pH值。此系統(tǒng)與細(xì)胞質(zhì)環(huán)境中的酶活性有著密切的關(guān)系。

1.1 F1F0-ATP酶

F1F0-ATP酶是一多亞基分子，其既能在消耗ATP的條件下產(chǎn)生分子跨膜動力，也能在分子跨膜動力的推動下產(chǎn)生ATP。分子跨膜動力需要將細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)中的H+排到胞外，從而使細(xì)胞內(nèi)的pH值升高。F1F0-ATP酶受atp操縱子的編碼調(diào)控。atp操縱子含有編碼F1F0-ATP酶5個亞基（α,β,δ,γ,ε） 的所有基因。F1（α3 β3 δγε） 組分含有催化亞基， 可以催化ATP的水解。F0（a b c）組分是一個跨膜的質(zhì)子通道，質(zhì)子經(jīng)過通道進入基質(zhì)的過程與ATP的形成偶聯(lián)。研究證明，在另外一條電子傳遞途徑失活狀態(tài)下，F(xiàn)1F0-ATP酶對于乳酸菌的生長起著至關(guān)重要的作用[2，3]。實驗表明，嗜酸乳桿菌中atp（編碼F1F0-ATP酶亞基）mRNA在低pH條件誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄量明顯增加[4]。

1.2 K+-ATP酶

陽離子轉(zhuǎn)運ATP酶，例如K+-ATP酶，同樣也對胞內(nèi)pH的動態(tài)平衡起著重要作用。K+-ATP酶通過胞內(nèi)外K+與H+的交換來調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH的平衡。例如，對于生長外界pH值為5.0的變形鏈球菌而言，以葡萄糖為能源的細(xì)胞在缺乏25 mmol/L的K+和有25 mmol/L的K+兩種培養(yǎng)條件下，耐酸能力下降，僅僅可以經(jīng)受5.5和6.14的pH環(huán)境[5]。

1.3 谷氨酸脫羧酶

谷氨酸脫羧酶可通過在脫羧反應(yīng)中消耗H+來調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH。谷氨酸在特定運載體的協(xié)助下轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)，在谷氨酸脫羧酶的催化作用下消耗H+發(fā)生脫羧反應(yīng)。谷氨酸脫羧反應(yīng)的產(chǎn)物-γ-氨基丁酸，與反向運載體結(jié)合轉(zhuǎn)運出胞外[6]。由于H+消耗，胞內(nèi)的pH值上升；同時，由于相比于谷氨酸酸性更弱的γ-氨基丁酸的產(chǎn)生，胞外pH值也略有上升。研究證明，乳酸桿菌E1亞種丙氨酸脫羧酶催化的谷氨酸脫羧反應(yīng)與胞內(nèi)質(zhì)子的排出形成偶聯(lián)[7]。

2 堿性物質(zhì)的產(chǎn)生

乳酸菌除了通過質(zhì)子泵方式消耗胞內(nèi)質(zhì)子外，也可以通過產(chǎn)生堿性物質(zhì)中和胞內(nèi)質(zhì)子，調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH，主要包括精氨酸脫亞胺酶和脲酶途徑。

2.1 精氨酸脫亞胺酶

精氨酸脫亞胺酶代謝途徑是胞內(nèi)pH平衡的另一有效機制[8]。這一途徑由精氨酸脫亞胺酶、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶和氨基甲酸激酶組成。這三個酶催化精氨酸轉(zhuǎn)變成鳥氨酸、氨氣和CO2的反應(yīng)，并且反應(yīng)過程中每消耗1 mol精氨酸形成1 mol ATP。反應(yīng)產(chǎn)生的NH3與H+反應(yīng)使環(huán)境堿化，pH值升高。同時，形成的ATP促使細(xì)胞質(zhì)中的H+在F1F0-ATP酶的作用下排出胞內(nèi)。實驗表明，在培養(yǎng)基中添加47.5mM精氨酸可以保護鼠鏈球菌FA-1亞種在pH3.5或4.0環(huán)境中生存至少6 h[9]。

2.2 脲酶

脲酶能夠催化尿素分解生成CO2和NH3（每分子尿素生成兩分子NH3），從而使環(huán)境堿化。人們已經(jīng)在嗜熱鏈球菌和唾液鏈球菌中發(fā)現(xiàn)脲酶的活性。研究證明，脲酶催化的尿素分解代謝能夠保護唾液鏈球菌長時間處在酸環(huán)境中，而不死亡[10]。

3 細(xì)胞膜變化

由于編碼細(xì)胞膜合成、組裝和維修的基因突變，革蘭氏陽性菌對酸會很敏感[10]。研究證明，細(xì)胞膜上的脂肪酸組成變化對于細(xì)胞在pH值下降環(huán)境中生存起著關(guān)鍵的作用。在pH值為5的環(huán)境中成長的變形鏈球菌，與在pH值為7中生長的該菌相比，其細(xì)胞膜上單不飽和脂肪酸和長鏈脂肪酸的含量高[11]。高含量的單不飽和脂肪酸和長鏈脂肪酸，可以降低H+對細(xì)胞膜的滲透[1]。另外，乳酸乳球菌中參與肽聚糖合成的特定青霉素結(jié)合蛋白的失活也會導(dǎo)致細(xì)胞對pH的敏感性增加。這些研究充分說明，細(xì)胞膜組成變化，尤其是脂肪酸變化，對乳酸菌耐酸能力起著至關(guān)重要的影響。

此外，在酸性環(huán)境下，其他機制可能對維持細(xì)胞膜的完整性起著一定得作用。例如，在酒類酒球菌中，Lo18（小分子熱休克蛋白）可能參與熱或酸刺激后膜或包膜蛋白的穩(wěn)定[1]。在變形鏈球菌中，低pH條件下，ffh基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)。ffh缺陷型菌株對酸敏感，并且在低酸度刺激下不能快速加強細(xì)胞膜上F1F0-ATP酶活性，將胞內(nèi)H+及時排出去[12]。

4 大分子的保護修復(fù)

對生物大分子，例如蛋白質(zhì)和DNA，起著保護修復(fù)的作用的大量蛋白質(zhì)，在乳酸菌的適酸機制中起著不可缺失的作用。

4.1 蛋白質(zhì)損傷修復(fù)

陪伴蛋白通過蛋白質(zhì)分子的折疊、變性蛋白質(zhì)的復(fù)原保護以及損傷蛋白質(zhì)的排出等多種方式參與乳酸菌的適酸性調(diào)節(jié)[8]。在幾類乳酸菌關(guān)于適酸性調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究表明，陪伴蛋白經(jīng)常在低pH下高表達(dá)，可能是用來修復(fù)低酸條件下產(chǎn)生的損傷蛋白，或者促進蛋白質(zhì)的折疊[6]。大腸桿菌中，陪伴蛋白DnaK低酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的高表達(dá)增強了UrvA（UrvABC的必需亞基，在DNA損傷識別和核酸酶組裝中起著重要作用）的穩(wěn)定性[13]。這個觀察表明，陪伴蛋白在適酸調(diào)節(jié)中起作用的原因之一是確保DNA損傷修復(fù)機制的正常表達(dá)。在乳酸菌中普遍存在的對適酸性調(diào)節(jié)有作用的陪伴蛋白DnaK和GroEL均屬于熱休克蛋白[14]。變形鏈球菌中的dnaK和groE操縱子以及乳酸乳球菌中的groE和clpP操縱子[15-17]的研究表明，其低pH值誘導(dǎo)是由其常用的熱休克調(diào)控子HrcA和CtsR調(diào)節(jié)。

4.2 DNA損傷修復(fù)

胞內(nèi)環(huán)境的過度酸化會導(dǎo)致DNA脫嘧啶和脫嘌呤。這個過程涉及堿基的質(zhì)子化以及隨后的堿基和戊糖之間糖苷鍵的斷裂。堿基缺失位點處保留的殘基稱為脫堿基位點或者AP（apurinic,apyrimidique）位點。在乳酸乳球菌中，溫和的紫外輻射可以誘導(dǎo)產(chǎn)生包括適酸機制在內(nèi)的幾種應(yīng)激機制，同時，四種在適酸反應(yīng)中高表達(dá)的蛋白質(zhì)也會在DNA損傷治療的誘導(dǎo)下表達(dá)。這表明乳酸菌適酸調(diào)節(jié)機制可能也包括DNA損傷修復(fù)機制[6]。變形鏈球菌中，耐乳酸調(diào)節(jié)機制通過酸誘導(dǎo)的不依賴于RecA的DNA損傷修復(fù)機制增強了對DNA損傷的抗性[18]。這進一步證實了乳酸菌適酸機制中DNA損傷修復(fù)機制的存在。

研究表明，pH值為5培養(yǎng)下的變形鏈球菌針對AP位點的核酸內(nèi)切酶活性增高[19]。同時其他研究表明，變形鏈球菌的uvrA（uvrA是核苷酸切除修復(fù)機制的必需成分之一）缺陷型菌株在乳酸耐酸調(diào)節(jié)表現(xiàn)出缺陷，與野生型菌株對比，在致命pH條件下，存活率下降10倍[20]。因此，在耐酸性調(diào)節(jié)中，這兩種DNA修復(fù)機制可能同時起作用。

5 耐酸機制的調(diào)節(jié)

細(xì)菌通?？梢酝ㄟ^雙組分系統(tǒng)感受細(xì)胞外環(huán)境的變化，并對其進行響應(yīng)，進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整以適應(yīng)變化的環(huán)境。研究表明，雙組分系統(tǒng)也參與了乳酸菌的耐酸調(diào)節(jié)。在乳酸乳球菌中，幾種雙組分系統(tǒng)缺陷型表現(xiàn)出了與耐酸性調(diào)節(jié)相關(guān)的類型[21]。有研究表明，變形鏈球菌可以通過與群體感應(yīng)相關(guān)的胞外信號系統(tǒng)來刺激其耐酸性調(diào)節(jié)。

同時其他系統(tǒng)也參與了乳酸菌耐酸性調(diào)節(jié)。乳酸乳球菌高親和力磷酸運載體（pst操縱子）缺陷型菌株對酸有高耐受性[22]。低pH可以降低磷酸運載體的活性，推測磷酸調(diào)控的調(diào)控子可能在乳酸耐酸調(diào)節(jié)中起著一定作用[8]。乳酸乳球菌rcfB突變型在致死pH條件下的存活率比野生型低130倍，表明RcfB在耐酸調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[22]。另外，乳酸乳球菌中涉及鳥嘌呤核苷酸代謝的基因（guaA，GMP合成酶和relA，（p）ppGpp合成酶）的失活將導(dǎo)致酸抗性[23]。此外，變形鏈球菌中的SGP蛋白（鏈球菌的GTP結(jié)合蛋白，變性鏈球菌的必需GTP酶）可能也參與了耐酸性調(diào)節(jié)過程，其功能之一就是調(diào)節(jié)GTP/GDP含量[24]。

6 展 望

如上文所述，乳酸菌存在多種適酸性調(diào)節(jié)機制，通常適酸調(diào)節(jié)都是幾種機制的交叉作用。乳酸菌中存在多種參與適酸性調(diào)節(jié)的基因，其實際功能及調(diào)節(jié)特點可能會存在較大差異。要獲得完整地適酸性調(diào)節(jié)機制信息，需要大量深入工作。乳酸菌全基因組的測序，毫無疑問地推動了適酸性調(diào)節(jié)相關(guān)基因的發(fā)掘和研究。乳酸菌耐酸基因以及機制的深入研究，勢必為乳酸菌的深度利用和開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

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Regulation of acid adaptation in Lactic acid bacteria

QIAO Lei1,CUI Yan-hua1,QU Xiao-jun2
（1.School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China；2.Institute of Microbiology,Heilongjiang Science Academy,Harbin 150010,China）

The understanding of acid adaptation mechanisms of LAB will benefit screening the acid-tolerance bacteria,the optimization of procedures in the ferment progress and optimization of culture.This will greatly improve the quality of fermented foods.The acid adaptation mechanisms were discussed,including proton pump,the production of alkali,the changes of membrane,protection or repair of macromolecules and the regulation of acid tolerance.

Lactic acid bacteria；proton pump；acid tolerance；regulation

Q936

B

1001-2230（2011）12-0024-03

2011-07-20

國家自然科學(xué)基金資助項目（30901048）。

喬磊（1990-），男，本科，研究方向為分子微生物學(xué)。

崔艷華