葛 昆 張敬國(guó) 臧愛(ài)民 (河北大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,保定071000)

1 引言

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,全球每年有超過(guò)120萬(wàn)人被診斷患有乳腺癌,其五年生存率與腫瘤分期密切相關(guān)。Ⅰ期或更早的乳腺癌病人五年生存率可大于95%,而當(dāng)乳腺癌發(fā)展到Ⅲ期或更晚期時(shí),病人的五年生存率還不到50%,早期診斷是治療乳腺癌、降低死亡率的關(guān)鍵。目前臨床上檢測(cè)早期乳腺癌的方法主要有鉬靶X線攝影、超聲、磁共振掃描(MRI)等影像學(xué)手段。在我國(guó),受核磁檢查費(fèi)用所限,以MRI來(lái)開展原發(fā)癌的早期篩查尚不現(xiàn)實(shí);超聲雖然經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便,但存在著較高的漏診率;鉬靶X線影像主要適用于對(duì)40歲以上女性的檢測(cè),盡管如此,原位癌的檢出率還不到50%,而且小腫塊也不易被發(fā)現(xiàn)[1,2]。

腫瘤標(biāo)志物一直被認(rèn)為是最具潛力的腫瘤早期檢測(cè)手段之一,是腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ),對(duì)腫瘤的免疫診斷、藥物治療、免疫生物治療能起到重要的靶向作用。目前臨床上使用的乳腺癌標(biāo)志物多為血清中的腫瘤相關(guān)蛋白,主要有CA125、CA153、CEA、CA199和CA27-29,普遍存在陽(yáng)性率偏低,敏感度和特異度難以兼顧的問(wèn)題,對(duì)進(jìn)展期乳腺癌和轉(zhuǎn)移癌還有一定的診斷價(jià)值,但對(duì)早期診斷意義十分有限。自身免疫抗體是目前最受關(guān)注的一類腫瘤標(biāo)志物候選分子。應(yīng)用自身免疫抗體作為早期腫瘤的監(jiān)測(cè)指標(biāo),能比現(xiàn)有的臨床手段提前幾個(gè)月甚至幾年發(fā)現(xiàn)癌癥[1,3]。另外,自身免疫抗體在腫瘤的病情監(jiān)測(cè)、臨床分期、預(yù)后分析及藥物靶點(diǎn)研究等方面都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文就自身免疫抗體在乳腺癌早期檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值作一綜述。

2 腫瘤相關(guān)抗原與自身免疫抗體的產(chǎn)生

腫瘤相關(guān)自身免疫抗體是機(jī)體針對(duì)特異性腫瘤相關(guān)抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答產(chǎn)物,血清表達(dá)水平高且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。這些抗原主要是細(xì)胞癌變過(guò)程中出現(xiàn)的新抗原及過(guò)量表達(dá)的抗原,通常經(jīng)糖基化、磷酸化、氧化、蛋白酶切割等翻譯前修飾過(guò)程,會(huì)形成新的抗原表位或增加自體抗原表位,從而被免疫系統(tǒng)識(shí)別為外來(lái)物質(zhì),與主要組織相容性復(fù)合體或輔助性T細(xì)胞結(jié)合引發(fā)免疫反應(yīng),產(chǎn)生自身免疫抗體。不過(guò)大多數(shù)腫瘤自身免疫抗體是針對(duì)過(guò)量表達(dá)的抗原產(chǎn)生的,如p53的免疫源性來(lái)自于過(guò)表達(dá)、點(diǎn)突變及其在腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)和核內(nèi)的積累。過(guò)量表達(dá)的蛋白能增加抗原負(fù)載,引發(fā)癌癥病人機(jī)體產(chǎn)生抗體[4]。

由于腫瘤相關(guān)抗原一般來(lái)源于胞內(nèi),而胞內(nèi)蛋白是如何激發(fā)體液免疫反應(yīng)的,目前還不是很清楚。一種假設(shè)是異常腫瘤細(xì)胞死亡后,修飾過(guò)的胞內(nèi)蛋白被釋放到胞外,從而引發(fā)體液免疫反應(yīng)[5];另一種假設(shè)是異常死亡的腫瘤細(xì)胞所釋放的腫瘤相關(guān)抗原與白細(xì)胞和未成熟的樹突狀細(xì)胞G-蛋白受體相偶聯(lián),導(dǎo)致白細(xì)胞和未成熟的樹突狀細(xì)胞遷移[6]。這一組織特異性腫瘤相關(guān)抗原的趨化活性可能會(huì)給免疫系統(tǒng)提供組織損傷的危險(xiǎn)信號(hào),而且腫瘤相關(guān)抗原與未成熟的樹突狀細(xì)胞相互作用也能產(chǎn)生免疫源性,從而激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體促進(jìn)組織修復(fù)。

還有一種假設(shè)與特異免疫源性修飾有關(guān),腫瘤相關(guān)抗原與外來(lái)抗原結(jié)構(gòu)相似,因而可引發(fā)體液免疫。腫瘤相關(guān)抗原與熱休克蛋白(heat shock proteins)結(jié)合可形成有免疫調(diào)節(jié)特性的熱休克蛋白[7,8]。胞內(nèi)蛋白定位到腫瘤細(xì)胞表面將會(huì)被免疫系統(tǒng)識(shí)別為異己,繼而激發(fā)免疫反應(yīng)。血液中發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)多肽有些來(lái)源于胞內(nèi),也可被認(rèn)為是潛在的抗原。如肝癌病人血清中發(fā)現(xiàn)的鈣網(wǎng)蛋白片段和內(nèi)源性循環(huán)系統(tǒng)的蛋白等[9,10]。最近Villanueva等[10]研究指出由腫瘤細(xì)胞分泌的胞外蛋白酶,以協(xié)同或補(bǔ)充降解途徑的方式切割蛋白產(chǎn)生腫瘤相關(guān)多肽,而由此方式產(chǎn)生的多肽其免疫源性也更加多樣化。

針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可以發(fā)生在腫瘤形成的早期階段,因此可以在其它腫瘤標(biāo)志物和細(xì)胞表型發(fā)生變化之前從癌癥病人血清中檢測(cè)到高滴度的自身免疫抗體,使之成為癌癥早期檢測(cè)的分子信號(hào)[2]。這些腫瘤相關(guān)抗原在癌變過(guò)程中激發(fā)免疫應(yīng)答效應(yīng),從而可以作為臨床免疫治療的潛在靶標(biāo)。

3 自身免疫抗體對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值

根據(jù)免疫監(jiān)視理論,腫瘤的產(chǎn)生源于基因突變,從而導(dǎo)致腫瘤相關(guān)抗原的過(guò)量表達(dá),大多數(shù)腫瘤相關(guān)抗原都會(huì)引起人體免疫系統(tǒng)的識(shí)別,繼而引起一系列的免疫反應(yīng)[11]。所有這些免疫應(yīng)答都始于腫瘤形成初期,檢測(cè)到血液中這些腫瘤相關(guān)抗原的特異性抗體,也就實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤早期診斷的目的。

p53、HER2/neu、MUC1和 NY-ESO-1 的自身免疫抗體是最先應(yīng)用在乳腺癌診斷中的抗體類標(biāo)志物。這些有免疫活性的腫瘤相關(guān)抗原有助于識(shí)別自身免疫抗體構(gòu)象,是乳腺細(xì)胞癌變的關(guān)鍵因子。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)HSP60的過(guò)量表達(dá)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),HSP60的自身免疫抗體對(duì)非浸潤(rùn)性乳腺癌和浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌均有較高的診斷價(jià)值[12,13]。盡管如此,單一一種自身免疫抗體對(duì)早期乳腺癌的診斷特異性還有一定局限性。如HER2/neu自身免疫抗體雖然能在早期乳腺癌病人血清中檢測(cè)到,但并不是乳腺癌所特有的,其它癌癥中也普遍存在[2,5]。多種自身免疫抗體聯(lián)合使用是提高診斷敏感性和特異性的趨勢(shì)。

大部分腫瘤標(biāo)志物單獨(dú)使用時(shí)敏感性和特異性偏低,不能滿足臨床檢測(cè)的需要。鑒于腫瘤細(xì)胞具有雜合性,一種類型的癌癥可產(chǎn)生多種抗原引起的免疫應(yīng)答,因此聯(lián)合多種抗體診斷提高特異性是臨床應(yīng)用的一種必然趨勢(shì)[14]。Lu等[15]分析了乳腺癌病人 p53、HER2/neu、IGFBP-2和 TOPO2a的免疫活性,經(jīng)受試者工作曲線(ROC)分析,單獨(dú)使用p53并不是檢測(cè)乳腺癌的顯著指標(biāo)(AUC=0.48,P=0.538),p53和HER2/neu聯(lián)合AUC能提高到0.61(P=0.006),進(jìn)一步將四種標(biāo)志物聯(lián)合AUC達(dá)到0.63(P=0.001)。很多研究也報(bào)道了相似的結(jié)果,說(shuō)明聯(lián)合多種標(biāo)志物能實(shí)現(xiàn)較高的癌癥診斷敏感性和特異性。

值得注意的是,多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)乳腺癌也要根據(jù)臨床需要合理選用,過(guò)多指標(biāo)的聯(lián)合應(yīng)用不一定能提高臨床診斷價(jià)值,在腫瘤的診斷、隨訪檢測(cè)中應(yīng)該有所區(qū)分、分別對(duì)待。Chapman等[16]用7種抗原表達(dá)譜(p53、c-myc、HER2/neu、NY-ESO-1、BRCA1、BRCA2和MUC1)檢測(cè)了94例正常人血清,97例原發(fā)性乳腺癌病人血清和40例導(dǎo)管原位癌病人血清,統(tǒng)計(jì)分析顯示BRCA1沒(méi)有診斷價(jià)值,其它6種標(biāo)志物對(duì)原發(fā)性乳腺癌的診斷敏感性在8%～34%之間,對(duì)導(dǎo)管原位癌的診斷敏感性在3%～23%之間,對(duì)這兩種乳腺癌的診斷特異性都在91%～98%。聯(lián)合6種標(biāo)志物可將原發(fā)性乳腺癌的診斷敏感性提高到64%,導(dǎo)管原位癌的診斷敏感性提高到45%,特異性為85%,這與鉬靶X線影像對(duì)早期乳腺癌的檢測(cè)敏感性相當(dāng)。

選擇合適的能引發(fā)自身抗體的腫瘤抗原是一項(xiàng)艱巨的工作。目前Cancer Immunome Database數(shù)據(jù)庫(kù)中列出了2316個(gè)克隆的2743條序列,而且這一數(shù)字還在不斷增長(zhǎng)。然而大多數(shù)抗原不適合用于診斷,因?yàn)樗麄兊牡味忍?僅在某一類型的癌癥病人體內(nèi)存在,而且正常人和良性病變患者也能檢測(cè)到。通過(guò)篩查pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)中所有有關(guān)自身免疫抗體可能作為癌癥診斷指標(biāo)的研究,所有這些抗體至少要做5項(xiàng)調(diào)查才能納入最后的分析。就此有人提出了抗體診斷價(jià)值分析的3個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),只有具備其中兩項(xiàng)才能作為候選腫瘤標(biāo)志物:(1)必須有高滴度的血清學(xué)反應(yīng)(以1:1000計(jì)算);(2)要在至少40%的惡性腫瘤病人中檢測(cè)到;(3)正常人外周血中不存在。目前只有三種抗體符合這一標(biāo)準(zhǔn),MUC-1、p53和SOX。因此開發(fā)新的腫瘤抗體標(biāo)志物是目前工作的重點(diǎn)[14]。

4 自身免疫抗體篩選方法

已開發(fā)的乳腺癌自身免疫抗體種類較多,差異也大,這與病人遺傳背景、腫瘤大小及其檢測(cè)方法有關(guān)。事實(shí)上,自體抗原在良性疾病、炎癥和自身免疫疾病病人體內(nèi)都會(huì)存在,因此如何區(qū)分炎癥或其它非癌病變引發(fā)的自身免疫抗體和癌癥引發(fā)的自身免疫抗體成為關(guān)鍵問(wèn)題。蛋白質(zhì)組學(xué)為同時(shí)開發(fā)多種乳腺癌自身免疫抗體提供了有力手段。

4.1 SEREX SEREX技術(shù)以其操作簡(jiǎn)便易行、一次實(shí)驗(yàn)即可進(jìn)行疾病相關(guān)抗原cDNA的測(cè)序和分析、得到的腫瘤相關(guān)抗原可信度高等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用在腫瘤標(biāo)志物的篩選中。但其篩選效率比較低,在大規(guī)模開發(fā)腫瘤特異性自身抗原方面受到限制。應(yīng)用SEREX 發(fā)現(xiàn)了 annexin XI-A、p80、S6、RPA32 和NYESO-1等多種自體抗原[2,17-19]。其中NY-ESO-1被證明是免疫原性最強(qiáng)的腫瘤抗原之一,可同時(shí)激發(fā)患者體內(nèi)的體液免疫和細(xì)胞免疫,已被應(yīng)用于一些腫瘤的臨床免疫治療研究中。本研究小組在SEREX技術(shù)的基礎(chǔ)上,增加了文庫(kù)淘洗過(guò)程,發(fā)現(xiàn)了3種新的乳腺癌自身免疫抗體構(gòu)象[20]。

4.2 SERPA SERPA是另一種將蛋白質(zhì)組技術(shù)和血清學(xué)相結(jié)合的新方法,將2-DE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜后分別與患者和健康人血清雜交,通過(guò)比較兩組間的反應(yīng)性來(lái)查找目的蛋白,進(jìn)而運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定。RNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)亞基(RS),原癌基因DJ-1,葡萄糖6磷酸脫氫酶,熱休克蛋白70蛋白1(HS71),二氫脫氫酶等都是用此方法發(fā)現(xiàn)的乳腺癌腫瘤相關(guān)抗原。

4.3 蛋白微列陣 蛋白微列陣是自身免疫抗體構(gòu)象篩選的有利工具。它由固定于不同種類支持介質(zhì)上的蛋白微陣列組成,陣列中固定分子的位置及組成是已知的,用未經(jīng)標(biāo)記或標(biāo)記(熒光物質(zhì)、酶或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記)的生物分子與芯片上的探針進(jìn)行反應(yīng),然后通過(guò)特定的掃描裝置進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果由計(jì)算機(jī)分析處理。國(guó)內(nèi)外眾多研究表明,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在檢測(cè)敏感性和診斷特異性方面均明顯高于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)方法。Li等[21]應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)分析103例不同分級(jí)的乳腺癌患者血清標(biāo)本,篩選出的3個(gè)蛋白(4.3 kD、8.1 kD、8.9 kD)對(duì)0-Ⅰ期乳腺癌有較好的鑒別作用。

5 展望

乳腺癌病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的自身免疫抗體所對(duì)應(yīng)的蛋白,在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用,抗體與抗原都是腫瘤發(fā)生的分子基礎(chǔ)。與雷帕霉素敏感相關(guān)的mTOR(Mammalian target of rapamycin)磷酸化途徑蛋白如核糖體蛋白S6、真核細(xì)胞延伸因子2、真核細(xì)胞延伸因子2激酶、HSP90都是在乳腺癌病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原。乳腺癌病人體內(nèi)的自身免疫抗體也會(huì)直接與DNA修復(fù)相關(guān)組分Ku蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶1、復(fù)制蛋白A 32kD亞基等發(fā)生作用,影響細(xì)胞復(fù)制與增殖。

自身免疫抗體在癌癥早期檢測(cè)方面具有如下優(yōu)點(diǎn):(1)可以用來(lái)檢測(cè)無(wú)癥狀人群,甚至可以比現(xiàn)有的手段提前5年檢測(cè)到疾病[6]。(2)針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原產(chǎn)生的自身免疫抗體直接進(jìn)入外周血,檢測(cè)樣本易于獲取。(3)相對(duì)于抗原來(lái)說(shuō),抗體比較穩(wěn)定,不易水解,能相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間的存在于血清中。(4)抗體的濃度要高于相應(yīng)的腫瘤相關(guān)抗原,一個(gè)抗原分子激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的自身免疫抗體要擴(kuò)增很多倍,所以自身免疫抗體比腫瘤相關(guān)抗原更容易檢測(cè)。(5)半衰期長(zhǎng)(7天),因此樣品采集沒(méi)有嚴(yán)格的時(shí)間限制,樣品收集更容易。(6)目前已有多種試劑和技術(shù)可用來(lái)檢測(cè)自身免疫抗體。

同時(shí)自身免疫抗體的存在,也為開展免疫治療提供了新的靶點(diǎn)。HER2/neu抗體廣泛用在HER2陽(yáng)性乳腺癌病人的免疫治療中,作為新輔助化療的一種藥物,HER2/neu抗體對(duì)HER2/neu表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤病人有很好的治療作用,提高了無(wú)復(fù)發(fā)生存期[22]。由于免疫治療的靶標(biāo)不存在于正常人體內(nèi),對(duì)病人治療產(chǎn)生的副作用會(huì)相應(yīng)較小。目前根據(jù)體液和細(xì)胞免疫已開展了針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的各種抗腫瘤疫苗策略。隨著更多的腫瘤相關(guān)抗原及其自身免疫抗體的開發(fā),乳腺癌的早期診斷和免疫治療將跨向一個(gè)新的臺(tái)階。

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