劉雅妮，張海林

(河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，河北石家莊 050017)

鈣激活的氯通道(calcium-activated chloride channels，CaCCs)廣泛分布在內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、甚至血細(xì)胞等非興奮細(xì)胞，及心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等可興奮細(xì)胞。第一次發(fā)現(xiàn)CaCCs是在爪蟾的卵母細(xì)胞中［1］。胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度(［Ca2+］i)的升高引起CaCCs的開(kāi)放，使膜發(fā)生去極化，而抑制多精受精。CaCCs在許多生理活動(dòng)中起重要作用，如上皮細(xì)胞的分泌、心肌和神經(jīng)元的興奮、嗅覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

由于技術(shù)上的原因，CaCCs分子基礎(chǔ)的問(wèn)題一直未能解決，曾有報(bào)道認(rèn)為CLCA、ClC-3、Bestrophins是CaCCs分子基礎(chǔ)的候選基因，但以上蛋白分子產(chǎn)生的氯離子電流都與典型的天然CaCCs通道有明顯區(qū)別。最近幾個(gè)研究小組幾乎同時(shí)報(bào)道了CaCCs的分子基礎(chǔ)是跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)［2－4］，這將為在特定細(xì)胞和組織中研究氯離子通道的生理病理相關(guān)問(wèn)題及其作用機(jī)制提供新的研究平臺(tái)。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)TMEM16A在非興奮性組織起源的腫瘤中高表達(dá)［5］，而在相同起源的正常組織低表達(dá)或不表達(dá)。但是TMEM16A在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用尚不清楚。

1 CaCCs分子基礎(chǔ)及構(gòu)效關(guān)系

1.1 分子基礎(chǔ) 對(duì)于CaCCs的分子基礎(chǔ)，曾有過(guò)幾個(gè)候選者。第一個(gè)是CLCA，它是從牛的氣管中分離得到的蛋白。編碼各種CLCA蛋白的cDNA轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞系均能誘發(fā)鈣依賴(lài)的電流。然而，Gibson等人的研究表明CLCA蛋白是細(xì)胞粘附分子，可粘附在細(xì)胞表面或被分泌到細(xì)胞間質(zhì)中。ClC-3是CaCCs的另一個(gè)候選者。但是ClC-3產(chǎn)生的電流缺少電壓依賴(lài)性和鈣依賴(lài)性，而CaCCs是可被鈣離子直接激活的。ClC-3還與細(xì)胞容積激活的氯通道活性有關(guān)，但是ClC-3敲除小鼠有正常的鈣離子和容積激活的氯電導(dǎo)。Bestrophins最初是作為卵黃斑營(yíng)養(yǎng)不良的相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)的，是CaCCs的另一個(gè)候選者［6］。與經(jīng)典的天然CaCCs相比，bestrophins表達(dá)的氯電流對(duì)鈣離子有不同的親和力，電壓依賴(lài)性和對(duì)抑制劑的敏感性也不同。最近的研究表明，bestrophins為鈣離子通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜提供電動(dòng)力［7］。

2008年，3個(gè)研究小組幾乎同時(shí)用不同方法獨(dú)立指出了TMEM16A是CaCCs的分子基礎(chǔ)。體內(nèi)或體外TMEM16A沉默都能引起內(nèi)源性CaCCs功能的抑制。另一方面，在裸細(xì)胞表達(dá)異源的TMEM16A表現(xiàn)有鈣激活氯通道生理和藥理學(xué)特征。如，TMEM16A的離子選擇性順序(NO－3＞I－＞Br－＞Cl－＞F－)與報(bào)道的內(nèi)源性 CaCCs相似［8］。另外，TMEM16A表達(dá)產(chǎn)生的氯離子電流可被尼氟滅酸(niflumic acid，NFA)、5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(5-nitro-(3-phenylp ropylamino)-benzoic acid，NPPB)［9］、4，4'-二異硫氰酰-2，2'-二磺酸(4，4'-diisothiocyanatostilbene-2，2'-disulfonicacid，DIDS)抑制，他們的效價(jià)與報(bào)道的 CaCCs相似［6］。而后續(xù)研究表明TMEM16A與氯通道活性相關(guān)［10］。報(bào)道的高度一致表明了TMEM16A獨(dú)立構(gòu)成了CaCCs或者與其他未知蛋白共同構(gòu)成了CaCCs。

1.2 構(gòu)效關(guān)系 TMEM16A有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，氨基和羧基末端都在膜內(nèi)。由于8個(gè)跨膜區(qū)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和其在陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，TMEM16A也叫做 ANO1(anoctamin-1)。第5、6跨膜區(qū)帶正電荷的氨基酸突變成帶負(fù)電的谷氨酸可明顯改變通道對(duì)陰陽(yáng)離子的通透性，即改變通道的離子選擇性，這一實(shí)驗(yàn)初步推斷第5、6跨膜區(qū)可能形成一個(gè)折返環(huán)插入質(zhì)膜中，對(duì)通道孔的形成可能有貢獻(xiàn)［4，11］。但是，TMEM16A序列中并沒(méi)有熟知的鈣離子或鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，如EF手結(jié)構(gòu)。如果TMEM16A可以直接結(jié)合鈣離子，那很可能是通過(guò)一個(gè)新的未知微域。膜內(nèi)第一個(gè)折返環(huán)的4個(gè)緊鄰谷氨酸有可能是鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。這一結(jié)構(gòu)與鈣激活鉀通道的“鈣碗”相似［12］。

TMEM16A 有 4 個(gè)可選擇剪切片段 a、b、c、d，分別對(duì)應(yīng)116、22、4、26 的氨基酸長(zhǎng)度［13］。對(duì)人的不同組織器官分析TMEM16A片段結(jié)果顯示有多種表達(dá)模式。許多組織表達(dá)不同亞型:表達(dá)會(huì)跳過(guò)b或d，這一協(xié)調(diào)的模式可能說(shuō)明片段b和d功能互斥［7］。相反，c片段是都有的，但在大腦和骨骼肌上也有很小的跳躍。TMEM16A的氨基末端有一長(zhǎng)片段a，當(dāng)有可替代啟動(dòng)子時(shí)也可跳過(guò)，這就導(dǎo)致蛋白缺少開(kāi)始的116個(gè)氨基酸。但是缺少片段a轉(zhuǎn)錄出的蛋白也沒(méi)有片段b，c，d。這種亞型叫做TMEM16A(0)，只有840個(gè)氨基酸，而完整的TMEM16A(abcd)有1 008個(gè)氨基酸［2］。

膜片鉗實(shí)驗(yàn)顯示TMEM16A的不同選擇剪切有不同的功能。片段b能減少TMEM16A通道對(duì)鈣離子的親和力。因此，TMEM16A(abc)和TMEM16A(ac)對(duì)鈣離子的敏感性相差近4倍［13］。另外，4個(gè)氨基酸(谷氨酸－丙氨酸－纈氨酸－賴(lài)氨酸)對(duì)應(yīng)于片段c能改變電壓依賴(lài)性。有趣的是，片段c位于上述討論的可能的鈣結(jié)合位點(diǎn)4個(gè)谷氨酸殘基后面。表達(dá)異源的TMEM16A(0)會(huì)產(chǎn)生不同的氯電流，雖然是鈣依賴(lài)性的但是不受膜電位影響。此亞型的生理學(xué)特征還不清楚。

1.3 其他TMEM16蛋白 TMEM16A屬于TMEM16家族，此家族還包括其他9個(gè)成員，分別從 B到 K［5］。所有的TMEM16蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似，但同源性較低。TMEM16A的氨基酸序列有60%與16B相似。TMEM16B似乎也是構(gòu)成CaCC的分子基礎(chǔ)。與TMEM16A相比，TMEM16B的電導(dǎo)低10倍，鈣離子敏感性更低，動(dòng)力學(xué)活性更快［14］。這些不同可能指導(dǎo)識(shí)別通道門(mén)控和氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵蛋白域。TMEM16A與其他家族成員的同源性較低，與F、G、H、K相似度只有20% ～30%。然而，TMEM16的跨膜結(jié)構(gòu)部分的一級(jí)結(jié)構(gòu)，顯示了高度的序列保守性。這些差異較多的TMEM16蛋白可能編碼不同的其他離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)體。TMEM16F和16K在很多細(xì)胞和組織中高表達(dá)［15］。相反，TMEM16C和16G只特異性的分別表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)和前列腺。有趣的是，TMEM16E/ANO5(也叫做GDD1)是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)與人類(lèi)遺傳疾病相關(guān)的TMEM16基因。TMEM16E蛋白的生理學(xué)功能還不清楚，但是已知它位于細(xì)胞內(nèi)。有報(bào)道指出包括TMEM16A在內(nèi)的許多TMEM16蛋白，產(chǎn)生的氯電流是由細(xì)胞腫脹引起的［16］。然而，與TMEM16有關(guān)的氯離子通道的生理物理學(xué)特性與容積敏感的氯離子通道(volume sensitive chloride channel，VSOAC)不同。因此，TMEM16和VSOAC可能代表著與細(xì)胞體積調(diào)節(jié)有關(guān)的不同類(lèi)型的通道。

2 CaCCs的生理功能

2.1 上皮細(xì)胞分泌 CaCCs表達(dá)和發(fā)揮功能的重要位置之一就是上皮細(xì)胞。CaCCs為氯離子通過(guò)上皮細(xì)胞提供了路徑。分泌液通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入呼吸道，細(xì)胞內(nèi)積累的氯離子產(chǎn)生電化學(xué)梯度，通道開(kāi)放，氯離子流入細(xì)胞外間隙而降低電化學(xué)梯度。Tarran等［17］用ATP或 UTP刺激氣管，發(fā)現(xiàn)其會(huì)激活上皮細(xì)胞上的P2Y2嘌呤能受體，從而誘發(fā)Ca2+依賴(lài)的Cl－的分泌。UTP激活Gq-P2Y嘌呤能受體可釋放IP3進(jìn)而引起Ca2+的釋放。呼吸道上皮細(xì)胞共表達(dá)CaCCs和囊性纖維化跨膜通道調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)，上皮粘膜層似乎由 CFTR和CaCCs共同調(diào)節(jié)［17］，粘膜層的基礎(chǔ)水平由 CFTR控制，CaCCs則為液層的敏感調(diào)節(jié)因子?？ò湍憠A、組胺和核苷酸能引起腸道內(nèi)氯離子的短暫上調(diào)。這些激動(dòng)劑增加了胞內(nèi)鈣離子濃度，激活CaCCs進(jìn)而觸發(fā)了分泌活動(dòng)。然而，從囊性纖維性病人體內(nèi)得到的腸上皮細(xì)胞對(duì)這些激動(dòng)劑卻不敏感。所以雖然腸上皮細(xì)胞存在著CaCCs，但是他們的重要作用還需進(jìn)一步研究確定。

2.2 神經(jīng)興奮和心臟興奮性的調(diào)節(jié) 各種不同的神經(jīng)元細(xì)胞都有CaCCs的表達(dá)，如背跟神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia，DRG)神經(jīng)元、脊髓神經(jīng)元等。CaCCs在神經(jīng)元細(xì)胞中的功能還不是十分確定，但它們?cè)趧?dòng)作電位的復(fù)極化，膜振蕩行為中起關(guān)鍵作用。45%～90%的軀體感覺(jué)神經(jīng)元，如感受皮膚溫度、觸覺(jué)、肌張力、疼痛的神經(jīng)元，都有 CaCCs的表達(dá)［18］。軀體感覺(jué)神經(jīng)元的胞體構(gòu)成了背根神經(jīng)節(jié)，DRG可傳導(dǎo)不同刺激如皮膚溫度、疼痛和觸感。DRG的一個(gè)亞群——中等直徑(30～40 μm)感覺(jué)神經(jīng)元中顯示了 CaCCs的活性，這表明此通道與某些特殊的感覺(jué)傳導(dǎo)通路有關(guān)。最近的研究［10］表明小DRG神經(jīng)元上的CaCC電流介導(dǎo)了緩激肽(bradykinin，BK)引發(fā)的急性傷害性疼痛。BK通過(guò)B2受體和磷脂酶C級(jí)聯(lián)反應(yīng)使內(nèi)鈣釋放進(jìn)而激活CaCC。脊髓神經(jīng)元中也有CaCCs的表達(dá)。在脊髓神經(jīng)元中，Ecl約為±60 mV［6］。如果在動(dòng)作電位期間CaCCs開(kāi)放，可能會(huì)加速膜的復(fù)極化。這往往會(huì)限制動(dòng)作電位的重復(fù)發(fā)生。

CaCCs在許多物種的心肌動(dòng)作電位去極化過(guò)程中起了重要作用。在許多心肌細(xì)胞中，短暫的外向電流Ito2和Ito1對(duì)復(fù)極化的初相作用重大。Ito1是Ca2+敏感的K+電流，可被4-氨基吡啶抑制，Ito2是Ca2+激活的Cl－電流，卻對(duì)4-氨基吡啶不敏感［6］。CaCCs激活可產(chǎn)生Ito2，可導(dǎo)致膜去極化或復(fù)極化。在膜電位較正時(shí)，鈣-氯電流(ICl.Ca)為外向電流，氯離子內(nèi)流，使膜電位變負(fù)。在膜電位較負(fù)時(shí)，氯離子外流，ICl.Ca能加速去極化和早后除極。Ca2+的狀態(tài)起了關(guān)鍵作用，決定了CaCCs對(duì)總的瞬時(shí)外向電流的相對(duì)貢獻(xiàn)。例如，β-腎上腺素刺激L-型通道或使心率加快可增加CaCCs的活性，也加大了鈣-氯電流對(duì)膜復(fù)極化的貢獻(xiàn)［6］。相反，膜電位的早復(fù)極化限制了鈣的內(nèi)流，從而也限制了CaCCs的激活。

2.3 嗅覺(jué)轉(zhuǎn)導(dǎo) 蛙、大鼠、蠑螈的嗅覺(jué)感受器神經(jīng)元都有CaCCs的表達(dá)［6］。CaCCs對(duì)嗅覺(jué)刺激的傳導(dǎo)起重要作用。氣味會(huì)結(jié)合并激活嗅覺(jué)感受器神經(jīng)元纖毛膜上的G蛋白偶聯(lián)受體。這些受體激活腺苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生cAMP并打開(kāi)環(huán)核苷酸門(mén)控的通道，使Na+和Ca2+內(nèi)流。這樣就導(dǎo)致膜的去極化，使纖毛的［Ca2+］i升高，從而激活CaCCs。氯離子的外流(內(nèi)向電流)使膜進(jìn)一步去極化。藥物對(duì)氣味轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中產(chǎn)生的ICl.Ca有重要作用。在蛙的嗅纖毛，大鼠、非洲爪蟾、蠑螈的嗅覺(jué)感受器神經(jīng)元，尼氟滅酸(NFA)，氟芬那酸都可以抑制 ICl.Ca。

3 與腫瘤的關(guān)系

3.1 TMEM16A與腫瘤的關(guān)系 TMEM16A多年前就引起了腫瘤生物學(xué)家的興趣，那時(shí)還不知道它是離子通道，只知道他們?cè)谀[瘤細(xì)胞中高表達(dá)［5］。因?yàn)樗麄兘咏?xì)胞表面而且在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，因此他們被當(dāng)做治療的潛在靶點(diǎn)和腫瘤的生物標(biāo)記物。離子通道在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用，這并不是一個(gè)新的觀(guān)點(diǎn)，但是此通道家族對(duì)腫瘤蛋白質(zhì)組的研究卻提供了一個(gè)新的機(jī)制研究前景。胃腸間質(zhì)細(xì)胞瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)是在胃腸道中發(fā)現(xiàn)的最普遍的間質(zhì)細(xì)胞瘤。TMEM16A在此腫瘤中高表達(dá)［19］，現(xiàn)已成為鑒定GIST的標(biāo)志基因。雖然TMEM16A不是腫瘤發(fā)生的起因，但它可能支持腫瘤的發(fā)展。TMEM16A位于染色體11q13，而在很多腫瘤組織中該染色體區(qū)都是擴(kuò)增的，這包括幾乎一半以上的鱗狀上皮細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinomas，OSCC)，人頸鱗狀細(xì)胞癌。這就表明染色體11q13的擴(kuò)增是由一組能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的基因驅(qū)動(dòng)的。

雖然TMEM16A在腫瘤組織中高表達(dá)，但TMEM16A的突變與致癌作用并沒(méi)有聯(lián)系。更確切說(shuō)，TMEM16A可能參與了細(xì)胞增殖或腫瘤發(fā)展。Kramer等發(fā)現(xiàn)當(dāng)果蠅中TMEM16(Axs)點(diǎn)突變后會(huì)導(dǎo)致染色體不分離而影響減數(shù)分裂周期。Axs與TMEM16H、K有35%的相似。與他們一樣，Axs缺少折返環(huán)。這是否意味著Axs不是一個(gè)氯通道或者說(shuō)這部分蛋白對(duì)氯通道的功能是可有可無(wú)的，仍需驗(yàn)證。Axs在胚胎發(fā)育早期位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在減數(shù)分裂紡錘體期位于膜上。Axs點(diǎn)突變后Axs(D)會(huì)導(dǎo)致染色體不分裂，這表明在紡錘體形成和細(xì)胞周期進(jìn)程中存在損傷。然而有趣的是，敲除Axs并不能重現(xiàn)Axs(D)的現(xiàn)象［20］?？赡苁且?yàn)辄c(diǎn)突變Axs(D)會(huì)產(chǎn)生具有打亂減數(shù)分裂功能的新蛋白。而敲除后其他的TMEM16家族成員會(huì)替代Axs的功能。

3.2 其他TMEM16蛋白 其他的TMEM16蛋白與腫瘤也有關(guān)系。TMEM16G，也被叫做NGEP，特異性的表達(dá)在前列腺癌中［21］。TMEM16G剪切片段影響小鼠乳腺癌的遷移能力，而且與人類(lèi)乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)。因?yàn)門(mén)MEM16G在前列腺的特異表達(dá)，或許會(huì)成為潛在治療靶點(diǎn)。

4 TMEM16A功能特異性調(diào)節(jié)劑

在鑒定TMEM16A為CaCCs的分子基礎(chǔ)后，很多實(shí)驗(yàn)小組著眼于研究TMEM16A的抑制劑，并取得了很大進(jìn)展。Namkung等［22］發(fā)現(xiàn)紅酒和綠茶中存在的天然化合物鞣酸能明顯抑制TMEM16A電流而不影響CFTR和ENaC(Na+轉(zhuǎn)運(yùn)體)，同時(shí)也不影響ATP和ionomycin誘發(fā)的胞內(nèi)鈣離子濃度升高，其 IC50為6 μmol·L－1。鞣酸濃度較高時(shí)能完全抑制TMEM16A電流，但同時(shí)也能抑制TMEM16B介導(dǎo)的電流。而Namkung等［23］的藥物篩選研究發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑苯并吡唑類(lèi)化合物能明顯抑制TMEM16A電流，抑制作用較強(qiáng)的A組化合物結(jié)構(gòu)母核為硫代乙?；B接的嘧啶環(huán)與苯并吡唑環(huán)，其中抑制作用最強(qiáng)的化合物T16Ainh-A01的IC50僅為1 μmol·L－1。這些抑制劑直接作用于TMEM16A，而不是作用于上游(如與激動(dòng)劑結(jié)合或鈣離子信號(hào))。雖然小分子抑制劑能明顯抑制TMEM16A電流，但也會(huì)同時(shí)抑制TMEM16B電流，所以篩選TMEM16A功能特異性的調(diào)節(jié)劑仍須努力。分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)對(duì)于研發(fā)治療高血壓、疼痛、腹瀉等疾病的藥物提供了支持。

5 結(jié)語(yǔ)

TMEM16A基因被報(bào)道為CaCCs的可能分子基礎(chǔ)后，其成為了眾多研究者的焦點(diǎn)，并取得了一些進(jìn)展。如Manoury等［24］發(fā)現(xiàn)在人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上，TMEM16A介導(dǎo)了CaCCs電流。另有研究表明頜下腺腺泡細(xì)胞和肝膽管上皮細(xì)胞均有TMEM16A的表達(dá)。盡管由于發(fā)現(xiàn)TMEM16A為CaCCs的分子基礎(chǔ)后對(duì)CaCCs的研究有了很大進(jìn)展，但仍存在有許多懸而未決的問(wèn)題。如在CaCCs的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)、CaCCs特異性抑制劑、TMEM16A基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及其影響機(jī)制，以及TMEM16家族其他蛋白功能等方面仍存在很多待解決問(wèn)題。而TMEM16A或許會(huì)成為治療多種人類(lèi)疾病如囊性纖維性病、高血壓、胃腸蠕動(dòng)障礙、哮喘和腫瘤的新型藥物靶點(diǎn)。

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