鄭其升，畢志香，李梅清，侯繼波，陳溥言

1 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014

2 山東省畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，濰坊 261061

3 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室，南京 210095

隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，疫苗研究正逐漸從傳統(tǒng)的滅活和減毒疫苗向基因工程疫苗過渡，特別是以病毒和細(xì)菌為載體的重組活疫苗的研制，有望克服常規(guī)疫苗的一些弊端。但同時，重組病毒的安全性問題也越來越多地受到人們的關(guān)注[1]。在獲得重組活載體疫苗后，一般隨同目的基因轉(zhuǎn)入載體的還有非目的基因，主要是抗性選擇基因或報告基因。利用標(biāo)記基因等可以從大量非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中將陽性重組克隆篩選出來，但隨著重組病毒的傳代，抗性選擇基因變得不再有用，卻仍在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這些基因也可能會進(jìn)入環(huán)境中，產(chǎn)生安全性問題。因此，如果在獲得重組活載體疫苗后，能除去這些非目的基因片段，可大大提高重組疫苗的安全性。

Cre/LoxP DNA重組系統(tǒng)具有位點特異、時期特異、組織特異和高效重組的特點，被廣泛用于細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲和哺乳動物的體內(nèi)、體外基因重組[2]。Cre和LoxP均來自于P1噬菌體，其介導(dǎo)因重組不需要其他蛋白質(zhì)或輔助因子參與，僅需納摩爾的量即可與LoxP位點結(jié)合，完成體內(nèi)或體外的DNA重組，將外源基因定點整合到染色體上或?qū)⑻囟ǖ腄NA片段刪除；Cre/LoxP重組系統(tǒng)在基因靶位操作、基因功能鑒定、外源基因整合等方面得到了廣泛的應(yīng)用，在轉(zhuǎn)基因酵母、植物、昆蟲、哺乳動物的體內(nèi)外DNA重組方面成為有力的工具[3-4]。

改良型痘苗病毒安卡拉株 (Modified vaccinia virus ankara，MVA) 是親本痘苗病毒安卡拉株經(jīng)雞胚成纖維細(xì)胞 (CEF) 連續(xù)傳代 500次以上所獲得的高度減毒的復(fù)制缺陷型痘苗病毒株。鑒于 MVA突出的安全性和免疫原性，近年來通過基因重組構(gòu)建的rMVA已被廣泛應(yīng)用于多種重要傳染病及腫瘤的疫苗研制，并已取得良好的效果[5-8]。在本研究中，我們構(gòu)建了一種實用新型可刪除篩選標(biāo)記雙表達(dá)穿梭載體pLR-gpt。為了徹底刪除篩選標(biāo)記實現(xiàn)重組病毒無標(biāo)記，將重組病毒的篩選標(biāo)記基因放在 2個同向LoxP位點間；而在2個LoxP位點外，設(shè)有2個多克隆位點，可插入目的基因表達(dá)盒。當(dāng)穿梭載體與MVA基因組發(fā)生同源重組后，利用gpt抗性篩選陽性克隆，然后將重組病毒接種 BHK-Cre細(xì)胞，2個同向LoxP位點間的篩選標(biāo)記基因?qū)⒈惶蕹?，最終獲得刪除篩選標(biāo)記的重組病毒。

為了驗證系統(tǒng)的有效性，將 PRRSVNJ-a株ORF5與ORF6基因分別克隆入pLR-gpt的2個多克隆位點中，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)，將構(gòu)建好的 pLR-ORF5/ ORF6轉(zhuǎn)染已感染親本MVA 2 h的BHK-21細(xì)胞單層，用藥物選擇性培養(yǎng)基 (MXHAT) 在24孔板上進(jìn)行連續(xù)篩選純化，得到帶有篩選標(biāo)記的重組病毒rMVAgpt-GP5/M。將rMVAgpt-GP5/M感染BHK-Cre，經(jīng)PCR和病毒生長曲線鑒定，獲得刪除篩選標(biāo)記的重組病毒rMVA-GP5/M，篩選標(biāo)記gpt已被完全刪除。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及細(xì)胞

MVA表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移載體pLR-lacZ，由美國范德比特爾大學(xué)傳染病學(xué)部張秀根博士惠贈，由本實驗室保存，其篩選標(biāo)記為lacZ基因；雞痘病毒表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移載體 pEFgpt12S，由美國明尼蘇達(dá)大學(xué)張玉根博士惠贈，具有一個痘苗病毒的雙向啟動子，其中P7.5調(diào)控篩選標(biāo)記Eco gpt基因的表達(dá)；克隆質(zhì)粒pBluescript SK II(+) 及宿主菌大腸桿菌DH5α，由本實驗室保存；質(zhì)粒pMD18-T載體購自TaKaRa公司；BHK-21細(xì)胞由本實驗室保存；表達(dá)Cre酶的BHK-21細(xì)胞系由本實驗室蘇鑫銘博士構(gòu)建；含有PRRSV NJ-a株ORF5及ORF6基因的重組質(zhì)粒由筆者構(gòu)建。

1.2 工具酶與試劑

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000、DL15000，限制性內(nèi)切酶PmeⅠ、AscⅠ、KpnⅠ、SacⅠ、ApaⅠ及T4 DNA連接酶、dNTPs、LA Taq DNA聚合酶為寶生物 (大連) 公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒購自上海華舜生物公司；霉酚酸 (Mycophenolic Acid，MPA)購自Sigma公司；黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷均購自Promega公司；LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司；胰酶購自Difico公司；兔抗PRRSV NJ-a株高免血清由本室制備，系用純化的 PRRSV NJ-a株多次免疫家兔制備；兔抗 PRRSV NJ-a株GP5、M 蛋白的特異性多抗由本室制備，系分別用純化的原核表達(dá)的重組GP5與M蛋白多次免疫家兔制備；HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG均購自晶美生物公司；其他各種化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)質(zhì)粒pLR-lacZ序列分析結(jié)果，在篩選標(biāo)記lacZ基因與左重組臂之間設(shè)計一對特異性引物P1、P2，用于擴(kuò)增pLR-lacZ中除去lacZ的部分，在P1的5′端依次添加KpnⅠ與SacⅠ位點；在P2的5′端依次添加KpnⅠ、ApaⅠ與MluⅠ位點，在ApaⅠ位點之后加入了一個痘苗病毒早期轉(zhuǎn)錄雙向終止信號；根據(jù)質(zhì)粒 pEFgpt12S的序列分析結(jié)果，設(shè)計一對特異性引物 P3、P4，用于擴(kuò)增由痘苗病毒 P7.5啟動子調(diào)控表達(dá)的Eco gpt基因，在2條引物的5′端添加2個同向的LoxP基因序列，然后在LoxP基因序列外側(cè)分別加入 SacⅠ及 ApaⅠ位點；P5、P6為檢測重組MVA的特異性引物，所有引物均為上海英駿生物技術(shù)公司合成。

表1 PCR反應(yīng)所用引物Table 1 Primers used for gene PCR amplification in the study

1.4 可刪除篩選標(biāo)記雙表達(dá)穿梭載體 pLR-gpt的構(gòu)建

利用引物 P1、P2，以原有的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pLR-lacZ為模板，擴(kuò)增包括質(zhì)粒骨架、左右重組臂，以及痘苗病毒啟動子在內(nèi)的基因序列。PCR產(chǎn)物回收純化后用KpnⅠ單酶切，酶切產(chǎn)物再回收，在T4 DNA連接酶作用下自連，獲得刪除lacZ篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)移載體pLR。

利用引物P3、P4，以禽痘病毒表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移載體pEFgpt12S為模板，擴(kuò)增Eco gpt基因表達(dá)盒(P7.5+Eco gpt)，PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體后，獲得重組質(zhì)粒 pMD-LoxP-gpt-LoxP，將陽性質(zhì)粒送交大連寶生物生物工程公司進(jìn)行序列測定，以驗證2個同向LoxP位點與Eco gpt表達(dá)盒基因序列的正確性。將測序正確的質(zhì)粒，用AscⅠ與ApaⅠ雙酶切，回收目的基因，克隆入經(jīng)相同酶處理的質(zhì)粒 pLR，獲得改造后的重組轉(zhuǎn)移載體，命名為pLR-gpt。

1.5 含有 PRRSV 基因的雙表達(dá)穿梭載體pLR-ORF5/ORF6的構(gòu)建

用PmeⅠ與AscⅠ雙酶切PRRSV NJ-a株ORF5基因后克隆入 pLR-gpt相應(yīng)的位點中，獲得重組質(zhì)粒pLRgpt-ORF5；利用SacⅠ與ApaⅠ雙酶切PRRSV NJ-a株ORF6基因后克隆入pLRgpt-ORF5相應(yīng)的位點中，獲得共表達(dá)PRRSV NJ-a株ORF5與ORF6基因的重組MVA轉(zhuǎn)移載體pLRgpt-ORF5/ORF6。

1.6 刪除篩選標(biāo)記重組MVA的獲得及刪除

重組轉(zhuǎn)移載體與親本 MVA的共轉(zhuǎn)染照LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書步驟進(jìn)行。用含2% MXHAT的DMEM 10倍連續(xù)稀釋病毒，接種到長滿單層BHK-21細(xì)胞的24孔板，接毒量500 μL/孔，37 ℃吸附1 h，用PBS洗滌2次，用含2%胎牛血清的選擇性培養(yǎng)基維持，每隔 48 h換 1次液，逐日觀察，收獲稀釋倍數(shù)大且出現(xiàn)病變孔的病毒液，如此反復(fù)，直到病毒在選擇性培養(yǎng)基和正常培養(yǎng)基中的TCID50值達(dá)到一致，表明重組病毒已純化，為防止細(xì)胞脫落，在接毒前2 h更換選擇性培養(yǎng)基。

以0.1 MOI接種純化的rMVAgpt-GP5/M于長滿BHK-Cre細(xì)胞的6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞病變明顯后收獲病毒。收獲病毒分為 2份，1份重新接種BHK-Cre細(xì)胞，另1份接種BHK-21細(xì)胞，用2%的MXHAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)反復(fù)傳代篩選，直到所收獲病毒在 BHK-21細(xì)胞上以選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)不形成病變，得到刪除篩選標(biāo)記的重組病毒rMVA-GP5/M。

1.7 重組MVA篩選標(biāo)記刪除的鑒定

提取rMVAgpt-GP5/M與rMVA-GP5/M病毒基因組作為模板，利用引物P5、P6進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，以鑒定篩選標(biāo)記基因在MVA基因組中的插入與缺失，同時設(shè)親本MVA基因組DNA對照。

取純化的rMVA-GP5/M、rMVAgpt-GP5/M和親本MVA，分別以2.0 MOI感染24孔板BHK-21細(xì)胞單層，37 ℃吸附1 h，用DMEM沖洗3 次，加入含2% FCS的DMEM與含2% MXHAT選擇性培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在接毒后12、24、48、72 h時，收獲病毒，測定病毒的TCID50，繪制生長曲線。

1.8 外源基因表達(dá)的鑒定

1.8.1 重組病毒W(wǎng)estern blotting分析

將純化的rMVA-GP5/M按2.0 MOI接種單層的BHK-21細(xì)胞，感染48 h后收集并裂解細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜后以兔抗PRRSV NJ-a株多克隆抗體為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體為二抗進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色后觀察是否存在與預(yù)期蛋白大小一致的蛋白條帶。

1.8.2 重組病毒IFA鑒定

將純化的rMVA-GP5/M按2.0 MOI接種單層的BHK-21細(xì)胞，在感染后 48 h，棄營養(yǎng)液，每孔用PBS (pH 7.4) 洗滌3次，加?20 ℃預(yù)冷的固定液 (丙酮∶乙醇=6∶4)，固定5 min，用PBS漂洗3次后空氣干燥；分別加入1∶100稀釋的兔抗PRRSV NJ-a株GP5或M蛋白的高免血清，37 ℃作用30 min；PBS漂洗3次后，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體，37 ℃作用45 min；PBS漂洗3次，風(fēng)干后直接觀察熒光。同時以MVA感染細(xì)胞作對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 骨架質(zhì)粒的獲得

以轉(zhuǎn)移載體 pLR-lacZ為模板，擴(kuò)增除去 lacZ基因的質(zhì)粒全長基因。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，可清晰看到位于4 000 bp附近的特異性條帶。PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)KpnⅠ單酶切，酶切產(chǎn)物再回收，在T4 DNA連接酶作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，堿裂解法提取質(zhì)粒，用KpnⅠ單酶切鑒定，可見約4 000 bp的單一片段 (圖略)，表明成功獲得骨架質(zhì)粒pLR，測序結(jié)果也證實了我們的結(jié)論。

2.2 帶有2個同向LoxP位點的Eco gpt基因表達(dá)盒的擴(kuò)增

以禽痘病毒表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pEFgpt12S為模板，利用引物 P3、P4，擴(kuò)增帶有 2個同向 LoxP位點的Eco gpt基因表達(dá)盒。PCR產(chǎn)物回收后克隆入pMD18-T載體，用SacⅠ與ApaⅠ雙酶切鑒定，可見2 600 bp的載體片段與890 bp的目的基因片段(圖略)，陽性重組質(zhì)粒命名為pMD-LoxP-gpt-LoxP。序列測定結(jié)果證實了LoxP位點及Eco gpt基因表達(dá)盒序列的正確性。

2.3 可刪除篩選標(biāo)記的雙表達(dá)轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建結(jié)果

將 pMD-LoxP-gpt-LoxP用 SacⅠ/ApaⅠ雙酶切，回收890 bp的條帶與用同樣2個酶處理的pLR進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑取白色菌落，堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng) SacⅠ與ApaⅠ雙酶切鑒定為陽性，命名為pLR-gpt (圖1)，表明帶有2個同向LoxP位點的以Eco gpt為篩選標(biāo)記的重組痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功，載體構(gòu)建的過程見圖2。

2.4 含有PRRSV基因的雙表達(dá)穿梭載體構(gòu)建結(jié)果

圖1 重組質(zhì)粒pLR-gpt的酶切鑒定Fig. 1 Identification of the recombinant plasmid pLR-gpt. 1: DNA marker DL2000; 2: recombinant plasmid pLR-gpt digested by SacⅠand ApaⅠ.

pLR-ORF5/ORF6用 PmeⅠ/AscⅠ或 MluⅠ/ ApaⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳，在紫外光燈下出現(xiàn)4 000 bp的載體片段及603 bp的ORF5基因或525 bp的 ORF6基因，表明重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功，結(jié)果見圖3。

2.5 刪除篩選標(biāo)記重組MVA的獲得及鑒定

以rMVAgpt-GP5/M為親本毒，在BHK-Cre細(xì)胞上篩選純化后得到 rMVA-GP5/M。rMVA-GP5/M在 2% MXHAT選擇性培養(yǎng)基中完全不能產(chǎn)生病變，說明在Cre酶的作用下，rMVAgpt-GP5/M中的Eco gpt表達(dá)盒已被正確刪除。

2.6 刪除篩選標(biāo)記重組MVA的鑒定

rMVAgpt-GP5/M中帶 2個同向 LoxP位點的Eco gpt表達(dá)盒為890 bp，本實驗設(shè)計的引物實際擴(kuò)增大小為 1 012 bp (下游引物位于重組臂上)，rMVA-GP5/M由于Eco gpt表達(dá)盒被刪除，所以沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，在Cre酶的作用下，Eco gpt表達(dá)盒被正確除去，結(jié)果見圖4。

2.7 外源基因表達(dá)的鑒定結(jié)果

2.7.1 Western blotting分析

由圖5可見，rMVAgpt-GP5/M感染的細(xì)胞能夠出現(xiàn)25 kDa和19 kDa的蛋白條帶，而親本毒對照孔沒有任何條帶。結(jié)果表明，構(gòu)建的重組病毒能夠同時表達(dá)GP5和M蛋白，并且表達(dá)產(chǎn)物具有與兔抗PRRSV NJ-a株陽性血清結(jié)合的能力。

圖2 改良型痘苗病毒安卡拉株表達(dá)系統(tǒng)可刪除篩選標(biāo)記的雙表達(dá)載體的構(gòu)建流程圖Fig. 2 Construction for the marker free bio-expression transfer vector of the MVA expression system expression system.

圖3 重組質(zhì)粒pLRgpt-ORF5/ORF6的雙酶切鑒定Fig. 3 Identification for the recombinant plasmid pLRgpt-ORF5/ORF6. 1: pLRgpt-ORF5/ORF6 digested with PmeⅠand AscⅠ ; 2: DNA marker DL2000; 3: pLRgpt -ORF5/ORF6 digested with MluⅠand Apa Ⅰ; 4: DNA marker DL15000.

圖4 重組病毒篩選標(biāo)記刪除的PCR鑒定Fig. 4 PCR identification for ECO gpt deletion of recombinant virus. 1: rMVAgpt-GP5/M amplified with primer P5 and P6; 2: rMVA-GP5/M amplified with primer P5 and P6; 3: DNA marker DL2000.

圖5 rMVAgpt-GP5/M的Western blotting鑒定Fig. 5 Western blotting analysis of rMVAgpt-GP5/M. 1: rMVAgpt-GP5/M reacts with PRRSV positive serum; 2: MVA reacts with PRRSV positive serum.

2.7.2 IFA鑒定

純化的rMVAgpt-GP5/M和親本毒MVA分別感染 BHK-21細(xì)胞，待病變明顯后進(jìn)行間接免疫熒光染色，結(jié)果 rMVAgpt-GP5/M 感染細(xì)胞經(jīng)與兔抗GP5、M 特異性多抗反應(yīng)后均呈現(xiàn)很強(qiáng)的綠色熒光(圖6)，而親本毒MVA感染細(xì)胞沒有熒光，進(jìn)一步證明重組病毒能同時表達(dá)GP5和M蛋白。

2.8 重組病毒在BHK-21細(xì)胞上的生長特性

圖6 IFA檢測重組病毒感染BHK-21細(xì)胞中PRRSV蛋白的表達(dá)Fig. 6 Immunofluorescence assay with rMVAgpt-GP5/M-infected BHK-21 cells. (A) rMVAgpt-GP5/M infected BHK-21 cells reacted with GP5-specific antiserum. (B) rMVAgpt-GP5/M infected BHK-21 cells reacted with M-specific antiserum. (C) Negative control.

圖7 重組病毒rMVAgpt-GP5/M、rMVA-GP5/M與親本毒MVA在2% DMEM培養(yǎng)基中的生長曲線Fig. 7 One-step growth cruve for rMVAgpt-GP5/M, rMVA-GP5/M and wtMVA in DMEM containing 2% FCS.

圖8 重組病毒rMVAgpt-GP5/M、rMVA-GP5/M與親本毒MVA在2% MXHAT培養(yǎng)基中的生長曲線Fig. 8 One-step growth cruve for rMVAgpt-GP5/M, rMVA-GP5/M and wtMVA in DMEM containing 2% MXHAT.

rMVA-GP5/M與rMVAgpt-GP5/M在BHK-21細(xì)胞上分別以普通培養(yǎng)基與選擇性培養(yǎng)基 (含 2% MXHAT) 進(jìn)行培養(yǎng)，生長曲線見圖 7、8。由圖 7可見，當(dāng)2個重組病毒在2% DMEM中培養(yǎng)時，滴度與親本毒MVA基本一致，說明外源基因的插入不影響病毒的增殖；由圖8可見，當(dāng)2個重組病毒在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，rMVAgpt-GP5/M滴度未發(fā)生明顯的變化，而rMVA-GP5/M與親本毒MVA的生長被完全抑制，也表明在 Cre酶的作用下，rMVAgpt-GP5/M中的Eco gpt表達(dá)盒已被正確刪除。

3 討論

MVA的親本病毒早先是從馬的痘損害中分離獲得，起初經(jīng)驢皮膚劃痕傳代，經(jīng)CEF連續(xù)傳516代后，其宿主范圍和組織病理表型發(fā)生了顯著的變化，除在CEF和極少數(shù)哺乳細(xì)胞 (BHK-21) 中能夠進(jìn)行有效增殖以外，在絕大多數(shù)哺乳細(xì)胞中都受到嚴(yán)格的限制。與親本病毒導(dǎo)致大的皮膚潰瘍痘痕不同，接種MVA后僅產(chǎn)生小的白色痘痕[9-10]。

改良型痘病毒安卡拉株是研究傳染病與癌癥重組活載體疫苗的首選載體?；钶d體疫苗能夠模仿體內(nèi)病毒感染的過程，向機(jī)體的免疫系統(tǒng)提供“危險信號”。另外，痘病毒的生活周期允許疫苗抗原能夠在感染細(xì)胞的細(xì)胞漿中進(jìn)行從頭合成，對抗原分子向MHC-Ⅰ類分子的有效遞呈，引發(fā)特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)特別有利。與復(fù)制型痘苗病毒不同，MVA的宿主范圍很窄，對人類及其他哺乳動物僅產(chǎn)生一過性感染，接種后的副反應(yīng)小。因此，許多利用MVA作為載體的前臨床疫苗已經(jīng)在動物模型中顯示了非常好的保護(hù)型體液免疫與細(xì)胞免疫反應(yīng)[10]。也正是由于MVA載體具有的這些優(yōu)點，使其從眾多的活病毒載體中脫穎而出，成為目前重組病毒活載體疫苗研究的熱點。目前，對重組MVA活載體疫苗的研究已進(jìn)入應(yīng)用階段。以其作為載體表達(dá) HIV gag-pol和env基因及瘧疾紅前期抗原CSP的重組活載體疫苗已分別進(jìn)入了臨床Ⅰ與Ⅱ試驗[12-13]。

本實驗室所用的 MVA表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移載體的篩選標(biāo)記為lacZ基因，雖然利用lacZ基因作為篩選標(biāo)記成功篩選到重組病毒的報道已經(jīng)很多，但是我們這套表達(dá)系統(tǒng)還是存在許多缺點。1) 篩選標(biāo)記基因lacZ過大 (3 500 bp)，使得整個轉(zhuǎn)移載體太大(7 200 bp)，不便于基因的操作。2) 生物安全性問題，利用此篩選標(biāo)記獲得的重組病毒最終不能去除篩選標(biāo)記，對于重組病毒的生物安全性存在嚴(yán)重的影響。3) 利用lacZ作為篩選標(biāo)記，在篩選過程中需要用低熔點瓊脂糖固定細(xì)胞以挑取噬斑，操作過于繁瑣。4) 原有的轉(zhuǎn)移載體只能進(jìn)行單基因表達(dá)或者對多個基因進(jìn)行融合表達(dá)，而不能對2個基因進(jìn)行共表達(dá)。

對該系統(tǒng)進(jìn)行改造后，轉(zhuǎn)移載體的篩選標(biāo)記Eco gpt基因大小只有890 bp，使轉(zhuǎn)移質(zhì)粒大大減小，方便了基因的操作；Cre/LoxP系統(tǒng)的引入提高了最終所獲得重組病毒的生物安全性，利用本實驗室所擁有的表達(dá)Cre酶的BHK-21細(xì)胞系 (BHK-Cre)，在最后獲得的重組病毒中，篩選標(biāo)記Eco gpt基因?qū)⒈粍h除，只保留一個LoxP位點；轉(zhuǎn)移載體改造后，又添加了一個由痘苗病毒P7.5調(diào)控表達(dá)的多克隆位點框，因此可以對 2個基因同時進(jìn)行共表達(dá)，這對于表達(dá)存在相互作用的2個蛋白特別有利?？傊?，本研究構(gòu)建的可刪除篩選標(biāo)記的雙表達(dá)穿梭載體，用于無篩選標(biāo)記的重組改良型痘苗病毒安卡拉株構(gòu)建，將為開發(fā)更安全高效重組 MVA活載體疫苗奠定基礎(chǔ)。

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