孫興魯 黃艷君 朱 江 浦冠勤

(1蘇州大學(xué)金螳螂建筑與城市環(huán)境學(xué)院，江蘇蘇州 215123; 2蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州 215123)

利用昆蟲(chóng)桿狀病毒(baculovirus)防治害蟲(chóng)是生物防治的一項(xiàng)重要內(nèi)容，但與化學(xué)殺蟲(chóng)劑相比，野生型桿狀病毒的殺蟲(chóng)譜窄、殺蟲(chóng)速度慢，局限了其在生物防治中的應(yīng)用。針對(duì)野生型桿狀病毒殺蟲(chóng)速度慢的不足，可通過(guò)現(xiàn)代分子生物技術(shù)對(duì)其進(jìn)行改造，以加快其殺蟲(chóng)速度，從而構(gòu)建出重組型的桿狀病毒。1986年，英國(guó)牛津大學(xué)的Bishop等［1］首先開(kāi)始進(jìn)行應(yīng)用昆蟲(chóng)專(zhuān)一性毒素基因重組桿狀病毒增強(qiáng)病毒殺蟲(chóng)效果的試驗(yàn)。20世紀(jì)80年代末期以來(lái)，重組桿狀病毒殺蟲(chóng)劑的研制成為生物防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

目前，構(gòu)建重組桿狀病毒殺蟲(chóng)劑的主要技術(shù)路線有3條［2］:一是鑒定并去除某種非必需基因來(lái)增加殺蟲(chóng)效果;二是插入某些外源基因以提高殺蟲(chóng)速度;三是通過(guò)修飾、缺失與宿主范圍相關(guān)的基因來(lái)拓寬病毒的殺蟲(chóng)譜。其中插入外源基因是目前構(gòu)建重組病毒殺蟲(chóng)劑最主要的方法。例如，將對(duì)昆蟲(chóng)特異性的毒素基因，調(diào)控昆蟲(chóng)代謝、發(fā)育的基因及某些酶基因等外源基因，插入昆蟲(chóng)病毒基因組以構(gòu)建重組病毒殺蟲(chóng)劑，提升控制宿主的效率。目前，采用較多的外源基因有螨蟲(chóng)毒素［3］、蝎子毒素［4］、?？舅兀?］、蜘蛛毒素［6］、蘇云金毒素［7］等。插入的外源基因大致可分為2種類(lèi)型，一類(lèi)為昆蟲(chóng)激素類(lèi)物質(zhì)，能破壞害蟲(chóng)的正常生長(zhǎng)，干擾昆蟲(chóng)體內(nèi)的生理代謝;另一類(lèi)是細(xì)菌和昆蟲(chóng)毒素，其機(jī)制是通過(guò)毒素作用，使害蟲(chóng)提早停止進(jìn)食或死亡。除了插入外源基因，還可通過(guò)刪除、修飾昆蟲(chóng)病毒基因組內(nèi)的某些基因，以增強(qiáng)病毒的殺蟲(chóng)效率或擴(kuò)大病毒的宿主域，提高昆蟲(chóng)病毒的殺蟲(chóng)作用。如:蛻皮甾體葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(egt)基因是桿狀病毒編碼，能對(duì)宿主蛻皮激素進(jìn)行糖基化修飾，使蛻皮激素失活或從宿主體內(nèi)清除，從而推遲幼蟲(chóng)入眠［8］;刪除egt基因可加速宿主昆蟲(chóng)的死亡［9］。本文概述了插入幾種外源基因重組昆蟲(chóng)桿狀病毒的研究狀況，同時(shí)對(duì)重組病毒的發(fā)展前景作了展望。

1 北非蝎毒素重組桿狀病毒

昆蟲(chóng)特異性神經(jīng)毒素AaIT來(lái)源于北非蝎子(Androctonus australis)，是由70個(gè)氨基酸組成的多肽，它對(duì)鱗翅目特別是夜蛾科的一些重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)有毒殺作用，且殺蟲(chóng)效率很高。它是昆蟲(chóng)重組桿狀病毒研究中采用最多，也最為成功的一類(lèi)外源毒素，最早由Stewart等［10］重組入苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus，簡(jiǎn)稱(chēng)AcMNPV)，與野生型AcMNPV對(duì)粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)效果進(jìn)行比較，3 d內(nèi)重組AcMNPV比野生型AcMNPV的半存活時(shí)間(ST50)縮短50%，甘藍(lán)葉面積的受害率降低50%。

姚斌等［11］將人工合成的 AaIT基因與膜蛋白gp64信號(hào)肽編碼序列融合后通過(guò)與AcMNPV同源重組，構(gòu)建了1株既能表達(dá)AaIT毒素又能形成包涵體的重組粉紋夜蛾核型多角體病毒(Trichoplusia ni nuclear ployhedrosis，簡(jiǎn)稱(chēng) TnNPV)，命名為 vTn-AaIT。受感染昆蟲(chóng)在2～3 d內(nèi)麻痹，停止危害作物，而病毒在昆蟲(chóng)體內(nèi)繼續(xù)增殖，最后蟲(chóng)體液化死亡。該重組TnNPV保留了多角體的啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因，表達(dá)量約為 P10蛋白的70%;使用該重組TnNPV對(duì)棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、粉紋夜蛾、苜蓿銀紋夜蛾等3～4齡幼蟲(chóng)進(jìn)行生物測(cè)定，結(jié)果表明:殺蟲(chóng)時(shí)間可由野生型TnNPV的5～7 d，縮短至2～3 d，半致死時(shí)間(LT50)縮短近50%，而且使蟲(chóng)體致死的劑量也顯著降低，這是我國(guó)構(gòu)建成功的第1株有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的基因工程殺蟲(chóng)病毒。

2 蘇云金桿菌毒蛋白重組桿狀病毒

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)是一種昆蟲(chóng)病原微生物，其主要的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)稱(chēng)為殺蟲(chóng)晶體蛋白(insecticidal crystal protein，簡(jiǎn)稱(chēng)ICP)。研究與實(shí)踐證明［12］:蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等500多種昆蟲(chóng)及線蟲(chóng)等有毒殺活性。蘇云金內(nèi)毒素(Cry1Ac)編碼的殺蟲(chóng)晶體蛋白是Bt產(chǎn)生的多種殺蟲(chóng)晶體蛋白中對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)有很高毒性的蛋白。Cry1Ac殺蟲(chóng)晶體蛋白的殺蟲(chóng)作用是毒素與昆蟲(chóng)中腸細(xì)胞上的專(zhuān)一性受體蛋白相互作用，并在細(xì)胞膜上形成孔道而實(shí)現(xiàn)的［13］。大量的研究數(shù)據(jù)表明［14］，Cry1 類(lèi)毒素之間的結(jié)構(gòu)域交換可以改變毒素的殺蟲(chóng)譜，影響原毒素的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和晶體的形成，甚至影響整個(gè)毒素的毒力。2003年Jin Hee Chang等［7］構(gòu)建了含蘇云金內(nèi)毒素晶體蛋白基因的重組型AcMNPV;該病毒可產(chǎn)生多角體與Bt毒素蛋白以及綠色熒光蛋白的融合蛋白;經(jīng)生物測(cè)定:重組型AcMNPV的半致死劑量(LD50)與ST50大大降低，LD50由野生型病毒的2798.3個(gè)多角體降為28.3個(gè)多角體，ST50由野生型病毒的92.8 h降為33.9 h，極大地提高了病毒的殺蟲(chóng)效率。

3 幾丁質(zhì)酶重組桿狀病毒

幾丁質(zhì)酶(chitinase)是一類(lèi)具有生物催化活性的水解酶，可降解昆蟲(chóng)體內(nèi)幾丁質(zhì)，而幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)體壁和中腸圍食膜的主要組分，體壁和圍食膜又是蟲(chóng)體抵御不良環(huán)境和外來(lái)生物侵染的重要屏障［15］，因此幾丁質(zhì)酶在害蟲(chóng)生物防治中愈來(lái)愈受到人們的重視。桿狀病毒幾丁質(zhì)酶基因(chitinase gene，簡(jiǎn)稱(chēng)ChiA)是桿狀病毒晚期表達(dá)的非必需基因，高度保守。在害蟲(chóng)生物防治中，桿狀病毒ChiA可直接作為殺蟲(chóng)劑，或在病毒基因組中插入外源ChiA，增強(qiáng)重組病毒的殺蟲(chóng)活性［16］。范曉軍等［17］將蝎毒素、幾丁質(zhì)酶與AcMNPV基因組同源重組的重組病毒(AcMNPV BmKIT ChiA)和野生型病毒作比較發(fā)現(xiàn)，兩者的半致死濃度(LC50)分別為7.5×102、3.3×104PIBs/mL(個(gè)多角體/mL)，重組病毒比野生型病毒具有更好的殺蟲(chóng)活性。

4 egt基因的缺失

桿狀病毒egt基因通過(guò)一種糖基化作用使宿主昆蟲(chóng)分泌的蛻皮激素失活，以延長(zhǎng)幼蟲(chóng)的取食時(shí)間，有利于桿狀病毒的大量繁殖［8］。因此，推測(cè)桿狀病毒基因組中egt的保留是其在鱗翅目昆蟲(chóng)寄主中長(zhǎng)期進(jìn)化的結(jié)果。egt基因編碼蛻皮甾體脲苷二磷酸葡糖轉(zhuǎn)移酶是桿狀病毒非必需的早期基因，同時(shí)也是昆蟲(chóng)病毒中迄今已知的唯一在個(gè)體水平調(diào)控感染宿主的基因［18］。刪除egt基因不影響病毒在細(xì)胞中的復(fù)制，但egt基因的缺失可以縮短被感染昆蟲(chóng)的致死時(shí)間，提高殺蟲(chóng)效果，減少作物的受害程度。O'Reilly等［19］首先構(gòu)建出缺失 egt的 AcMNPV，他們發(fā)現(xiàn)這種重組病毒感染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)幼蟲(chóng)的死亡速度比野生型快30%。Flipsen等［20］用缺失 egt基因的 AcMNPV感染甜菜夜蛾(Spodptera exigua)幼蟲(chóng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，幼蟲(chóng)的馬氏管提前被破壞，而感染野生病毒的幼蟲(chóng)的馬氏管沒(méi)有變化，據(jù)此推測(cè):幼蟲(chóng)馬氏管的退化是egt基因的缺失對(duì)蛻皮激素調(diào)節(jié)的結(jié)果。

5 擴(kuò)大重組桿狀病毒的宿主域

桿狀病毒大都具有很窄的宿主域，作為殺蟲(chóng)劑，一方面，窄的宿主域可保證非靶標(biāo)昆蟲(chóng)的安全，利于保護(hù)生態(tài)平衡;另一方面，卻限制了桿狀病毒殺蟲(chóng)劑的使用，我們希望一種殺蟲(chóng)劑可以作用于多種害蟲(chóng)。有關(guān)桿狀病毒宿主域決定機(jī)制的研究在分子水平上，目前仍在探索中。AcMNPV與家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，簡(jiǎn)稱(chēng)BmMNPV)基因組的核苷酸序列同源性為93%［21］;盡管二者同源性關(guān)系很近，但宿主域卻完全不同。AcMNPV和BmMNPV共同感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，可產(chǎn)生新的重組病毒，其宿主范圍較2個(gè)親本有所拓寬。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)位于BmMNPV解旋酶基因內(nèi)的79 bp序列，可在體外擴(kuò)大AcMNPV的宿主域;在該79 bp序列區(qū)域中，AcMNPV和BmMNPV有6個(gè)位點(diǎn)不同，AcMNPV基因組中在解旋酶蛋白的3個(gè)特異性氨基酸被相應(yīng)的3個(gè)BmMNPV特異性氨基酸替代后，其宿主范圍可擴(kuò)展到家蠶幼蟲(chóng)［22］。

6 重組桿狀病殺蟲(chóng)劑的研究與展望

目前昆蟲(chóng)桿狀病毒殺蟲(chóng)劑還無(wú)法取代化學(xué)殺蟲(chóng)劑，但其所擁有的對(duì)脊椎動(dòng)物安全、不污染自然環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)是化學(xué)殺蟲(chóng)劑所不具備的。桿狀病毒作為殺蟲(chóng)劑具有十分廣闊的應(yīng)用前景，桿狀病毒殺蟲(chóng)劑在解決了自身的缺點(diǎn)(如作用速度慢、宿主域窄等)后將會(huì)獲得良好的發(fā)展。目前，對(duì)野生桿狀病毒進(jìn)行改良，獲得重組桿狀病毒是昆蟲(chóng)桿狀病毒殺蟲(chóng)劑研制的主要方向。重組桿狀病毒殺蟲(chóng)劑的研究重點(diǎn)集中在桿狀病毒的基因工程，如尋找并插入合適的外源基因、刪除桿狀病毒非必須基因以及不同啟動(dòng)子的運(yùn)用。由于基因發(fā)生了改變，產(chǎn)生了自然界原本不存在的重組桿狀病毒，重組桿狀病毒的生物安全性尚需長(zhǎng)時(shí)間的深入研究，這也是目前重組桿狀病毒生物殺蟲(chóng)劑很少被批準(zhǔn)進(jìn)入環(huán)境釋放、商業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用的原因。

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