一種新的草甘膦抗性機制
——基因復(fù)增

編者按《PNAS》雜志上發(fā)表了美國科學(xué)家Todd A.Gaines等對從美國喬治亞州獲得的具有草甘膦抗性的紅根莧(Amaranthuspolmeri)研究中，發(fā)現(xiàn)其獲得草甘膦抗性是通過一種全新的基因復(fù)增機制。這一發(fā)現(xiàn)對草甘膦這一全球最重要的除草劑的持續(xù)使用以及向作物轉(zhuǎn)草甘膦抗性基因技術(shù)的持續(xù)使用將產(chǎn)生重要影響。本刊特請南京農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草研究室毛嬋娟碩士摘要譯出該文，以供廣大雜草科學(xué)工作者參考。

草甘膦是一種廣譜、莖葉處理、內(nèi)吸傳導(dǎo)型的滅生性除草劑。自抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化以來，草甘膦的使用量持續(xù)增加，目前已占到整個除草劑市場的20%以上。草甘膦的大量使用對雜草種群造成了巨大的選擇壓力。美國科學(xué)家Todd A. Gaines等對從美國喬治亞州獲得的具有草甘膦抗性的紅根莧(Amaranthuspalmeri)進行了研究，發(fā)現(xiàn)其獲得草甘膦抗性是通過一種全新的基因復(fù)增機制。這一結(jié)果發(fā)表在《PNAS》雜志上。

草甘膦的分子靶標(biāo)是葉綠體靶標(biāo)酶5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，它是莽草酸途徑的組成酶。具有草甘膦抗性的雜草種群的抗性機制是降低草甘膦的傳導(dǎo)或者EPSPS基因靶標(biāo)位點發(fā)生突變。在小白酒草和黑麥草中普遍的抗性機制為降低草甘膦的傳導(dǎo)，這種機制所產(chǎn)生的抗性比EPSPS基因靶標(biāo)位點突變所產(chǎn)生的抗性高7～11倍。在牛筋草、黑麥草以及一年生黑麥草中，EPSPS基因106位的脯氨酸發(fā)生突變，這種基因突變所產(chǎn)生的2～3倍的抗性已經(jīng)足以使得雜草種群在草甘膦使用地區(qū)得以延續(xù)。目前，在草甘膦抗性雜草中增加EPSPS基因的表達量還沒有被證實作為一種草甘膦抗性機制。

Todd A. Gaines等研究發(fā)現(xiàn)，在一些雜草種群中EPSPS基因靶標(biāo)位置突變可以產(chǎn)生2～3倍的草甘膦抗性，而在喬治亞州紅根莧中，通過PCR擴增獲得了草甘膦抗型和敏感型的紅根莧EPSPS cDNA的序列全長，進行序列分析，其106位的脯氨酸沒有發(fā)生突變。用0.4 kg/hm2的草甘膦對抗型和敏感型的紅根莧進行處理，8 h后，敏感型紅根莧出現(xiàn)了莽草酸的積累而抗型的沒有。采用定量RT-PCR檢測EPSPS基因的表達水平，參照基因為ALS，發(fā)現(xiàn)抗型紅根莧的EPSPS基因表達量比敏感型種群高出35倍。通過定量PCR發(fā)現(xiàn)，敏感型種群相對于ALS的基因拷貝數(shù)為1～1.3(n=12)，而抗型種群的EPSPS基因相對拷貝數(shù)為5～160(n=12)。擬F2種群對0.4 kg/hm2的草甘膦具有抗性。在擬F2種群中，EPSPS基因拷貝數(shù)與草甘膦抗性產(chǎn)生共分離現(xiàn)象。其中增加EPSPS基因相對拷貝數(shù)的個體在250 μmol/L草甘膦處理下不產(chǎn)生莽草酸的積累，說明在這濃度下對草甘膦具有抗性。擬F2中僅有1個EPSPS基因拷貝數(shù)的個體都產(chǎn)生了莽草酸的大量積累，說明它們對草甘膦敏感。采用定量RT-PCR對擬F2種群的EPSPS基因表達量進行測定，發(fā)現(xiàn)EPSPS與ALS基因拷貝數(shù)之比為1 ∶1的植株，EPSPS與ALS基因表達量也約為1 ∶1，EPSPS基因表達量隨著EPSPS基因拷貝數(shù)的增加而增加，且兩者之間存在顯著的相關(guān)性。通過免疫印跡法測定EPSPS蛋白表達量，在抗型、敏感型以及擬F2種群中，EPSPS信號強度與EPSPS基因組拷貝數(shù)存在顯著正相關(guān)。對EPSPS進行酶活測定，擬F2種群中的敏感型植株的EPSPS酶活遠低于抗型植株。EPSPS拷貝數(shù)大于1的樣品的IC50值與EPSPS拷貝數(shù)為1的樣品間不存在顯著性差異，說明草甘膦能同樣抑制抗性植株與敏感型植株體內(nèi)的EPSPS酶活。通過原位雜交(FISH)確定復(fù)增的EPSPS基因在染色體上的定位與分布，觀察到FISH信號在抗性個體的整個基因組中都有分布，這表明復(fù)增的EPSPS基因是隨機地插入到紅根莧的基因組中。抗性植株的EPSPS基因平均拷貝數(shù)為77±14(n=12)。

Gaines等的研究結(jié)果表明，紅根莧獲得草甘膦抗性的機制是多條染色體上EPSPS基因多拷貝復(fù)增。EPSPS基因復(fù)增導(dǎo)致EPSPS基因的表達量、EPSPS酶的活性大大增加，從而對草甘膦產(chǎn)生抗性?；驈?fù)增是在自然發(fā)生的雜草種群中產(chǎn)生的，這是一種新的雜草對草甘膦產(chǎn)生抗性的機制，對草甘膦這一全球最重要的除草劑的持續(xù)使用以及向作物轉(zhuǎn)草甘膦抗性基因技術(shù)的持續(xù)使用產(chǎn)生了威脅。

毛嬋娟(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 雜草研究室)摘譯自Todd A. Gaines，et al. Gene amplification confers glyphosate resistance inAmaranthuspalmeri[J]. PNAS,2010,107:1029-1034.