張 鈴，楊川毓 ，郭 鶯，阮妙鴻，林新期，陳如凱，張木清

（1.福建農(nóng)林大學甘蔗研究所，福州 350002；2.福建省亞熱帶植物研究所，廈門 361002；3.福建省農(nóng)業(yè)廳，福州 350003）

甘蔗花葉病是一種由病毒侵染引起的世界性甘蔗病害，主要破壞甘蔗葉片的葉綠體，嚴重制約其光合作用，從而使甘蔗的生長受到限制，糖分減少，產(chǎn)量下降。研究發(fā)現(xiàn)當花葉病病毒侵染率達到75%時，產(chǎn)量降低5%～19%[1]。選育和利用抗病品種是控制甘蔗花葉病的根本措施，但由于甘蔗是異源多倍體，遺傳背景復雜，常規(guī)條件下難以開花。因此傳統(tǒng)甘蔗抗病育種手段不僅周期長且效率低。Powel-Abel（1986）[2]最先報道了將TMV-CP基因?qū)霟煵葜蝎@得對TMV（煙草花葉病毒）具有抗性的轉(zhuǎn)CP基因煙草，為甘蔗抗花葉病基因工程育種提供了新的思路。澳大利亞Smith等（1996）[3-5]采用基因槍將甘蔗花葉病毒外殼蛋白（ScMV-CP）基因轉(zhuǎn)化到甘蔗的莖分生組織獲得了嵌合型的轉(zhuǎn)化植株，檢測表明外源基因已整合到甘蔗基因組中。Ivan L.Ingelbrecht（1999）等[6]以CP65-357和CP72-1210為受體，利用基因槍轟擊將高粱花葉病毒基因轉(zhuǎn)入甘蔗體內(nèi)。本實驗室（2003；2007）通過基因槍分別將ScMV-CP基因與SrMV-P1基因轉(zhuǎn)入甘蔗品種拔地拉（Badila）與福農(nóng)95-1702中，經(jīng)分子鑒定，目的基因已整合到甘蔗基因組中，且抗病鑒定結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因甘蔗對甘蔗花葉病抗病能力明顯提高[7-8]；后對其3年的田間發(fā)病率調(diào)查顯示轉(zhuǎn)基因甘蔗的發(fā)病率均低于5%。

目前有關(guān)獲得甘蔗抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗的報道不斷增多，與其他轉(zhuǎn)基因植物一樣，其生物安全性的問題也引起了許多爭論。近年，陸續(xù)出現(xiàn)了許多有關(guān)轉(zhuǎn)基因植物生物安全的報道，但有關(guān)抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗的研究報道卻十分少見?？够ㄈ~病轉(zhuǎn)基因甘蔗與其他轉(zhuǎn)基因材料有許多共同點，也存在許多不同點。因此，本文擬從抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗的食品安全、土壤生態(tài)安全、基因漂移、病毒的異源包裝與重組以及雜草化等方面進行逐一論述。

1 抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗的食品安全

抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗的外源基因是來源于甘蔗花葉病毒本身。有研究表明：甘蔗花葉病毒的熱鈍化溫度為53～55℃[9]。熱鈍化溫度是指使病毒喪失侵染力的最低溫度。作為蔗糖和酒精生產(chǎn)主要工業(yè)原料的甘蔗，其加工過程都需要經(jīng)過高溫煉煮。因此，在甘蔗的加工過程中，其體內(nèi)的核苷酸與蛋白都已經(jīng)失活，對最后產(chǎn)生的產(chǎn)品蔗糖和酒精可能不造成影響。但對于在加工過程中抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗的內(nèi)源毒素降解是否會對其重要的營養(yǎng)素造成影響，還有待進一步研究和觀察。

甘蔗除加工制糖、生產(chǎn)酒精外，也可以作為果蔗直接食用?？够ㄈ~病轉(zhuǎn)基因甘蔗所插入的相關(guān)病毒基因和標記基因以及抗生素的抗性基因等是否會對人的身體健康有所影響引起人們的很大關(guān)注。目前許多研究表明：在轉(zhuǎn)基因植物中病毒蛋白的表達，并不會給人類帶來不良的反應(yīng)，尤其值得注意的被病毒侵染的植物仍然作為食品被人們所消費，但還沒有見到其給人類帶來不良影響[10]。而目前抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗中常用的篩選標記基因是npt II。Fuchs等（1993）[11]對nptⅡ基因進行過嚴格的安全性評價，結(jié)果表明nptⅡ蛋白不會帶來安全問題。近年來，一些安全性標記基因（如pmi基因）在轉(zhuǎn)基因甘蔗上得到使用，也在一定程度上提高抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗的食品安全性[12]?？够ㄈ~病轉(zhuǎn)基因甘蔗中所用到的標記基因中包括抗生素抗性基因。目前學者普遍認為標記基因是安全的，但是抗生素的抗性基因可能會轉(zhuǎn)移到人體的腸道微生物或者上皮細胞中，從而對人體產(chǎn)生不利影響或者降低抗生素在臨床治療中的有效性。FDA（1994）對卡那霉素抗性基因Kanr的研究表明：抗生素的抗性基因不會引起安全性問題[13]，而且目前也沒有報道指出抗生素的抗性基因?qū)θ梭w有毒害作用。但是，抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗的食品安全性研究不能局限于此，仍要通過受體植物與供體生物歷史背景的分析、營養(yǎng)成分的評價、生物信息學分析、分子生物學技術(shù)、毒理學評價、致敏性評價等方面進行多層次、多角度的探討[14]。

2 抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗對土壤生態(tài)環(huán)境的影響

土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化的主要場所，并且作為植物生長的媒介，其生態(tài)功能不容忽視。因此，土壤中物質(zhì)代謝，主要微生物種群變化以及生物多樣性的穩(wěn)定性，是保證土壤生態(tài)功能正常、穩(wěn)定的前提基礎(chǔ)[15]。轉(zhuǎn)基因甘蔗與其親本在遺傳性狀、生理代謝、以及相關(guān)基因的表達產(chǎn)物上存在一定的差異，外源基因可能通過根系分泌物進入到土壤生態(tài)環(huán)境中，從而產(chǎn)生一些不可預測的影響。

2.1 對土壤物質(zhì)代謝的影響

氮、碳、磷代謝是土壤物質(zhì)代謝中的三大代謝，與其相關(guān)的脲酶、蔗糖酶、磷酸單脂酶等酶活性發(fā)生異樣，可能導致氮、碳、磷三大代謝發(fā)生混亂，從而一定程度上影響土壤對有機質(zhì)的分解、土壤生物的生態(tài)過程以及土壤結(jié)構(gòu)和肥力水平[16]。轉(zhuǎn)基因甘蔗由于其外源基因?qū)?，可能會對土壤物質(zhì)代謝造成一定的影響。阮妙鴻等研究表明：轉(zhuǎn)ScMV-CP基因甘蔗顯著（p＜0.05）降低了土壤脫氫酶的活性，提高了土壤的纖維素酶、蛋白酶和脲酶活性（p＜0.01），而對蔗糖酶和磷酸單脂酶沒有影響[17]。付云霞（2007）對轉(zhuǎn)SrMV-P1基因甘蔗在不同栽培方式，不同生育期進行研究表明：轉(zhuǎn)SrMV-P1基因甘蔗對根際土壤脲酶和酸性磷酸酶的活性影響很小，而對蔗糖酶、堿性磷酸酶和過氧化氫酶的活性皆有一定的影響[18]。鄭碧霞（2008）在付云霞的基礎(chǔ)上，對轉(zhuǎn)SrMV-P1基因甘蔗進行跟蹤研究表明：轉(zhuǎn)SrMV-P1基因甘蔗對根際土壤脲酶、蔗糖酶、堿性磷酸酶活性相比受體材料差異不顯著，而對酸性磷酸酶有一定的影響[19]。

綜上所述，導入不同的外源基因，可能使抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗對土壤代謝造成不同的影響。但由于影響土壤酶活性的因素眾多，所以不同的試驗，所受到的影響因素不同，可能得到不同的結(jié)果。且土壤酶活性的差別也可能是由植物生理特性的不同所引起。因此，目前有關(guān)抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗是否會給土壤中與氮、碳、磷相關(guān)代謝的酶造成影響，從而破壞土壤中正常的物質(zhì)及能量轉(zhuǎn)化，還有待進一步研究。

2.2 對土壤微生物種群的影響

抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗進入土壤后，土壤中的微生物利用植物根際分泌物進行自身的生長繁殖，它們之間相互作用且相互影響。主要體現(xiàn)在：土壤微生物分解土壤有機質(zhì)和促進腐殖質(zhì)形成；吸收和固定并釋放養(yǎng)分，對植物營養(yǎng)狀況的改善和調(diào)節(jié)有主要作用；與植物共生、促進植物生長等[20]。另外，土壤微生物特性對土壤基質(zhì)的變化敏感，其群落結(jié)構(gòu)組成等可以反映土壤肥力狀況。因此，近年來把土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的組成作為評價土壤健康的主要指標[15]。

阮妙鴻等通過盆栽、田間種植及人工殘體掩埋，利用BIOLOG Ecoplate TM微平板（BIOLOG Inc.，USA）結(jié)合微生物的平板培養(yǎng)及相關(guān)的土壤酶活性分析，研究了轉(zhuǎn)ScMV-CP基因甘蔗對根際土壤微生物的影響。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因甘蔗對土壤微生物數(shù)量和均勻度有一定影響，但對活性和多樣性的影響不明顯[21]。而付云霞（2007）通過對轉(zhuǎn)SrMV-P1基因甘蔗不同生育期根際土壤微生物的研究表明，轉(zhuǎn)SrMV-P1基因甘蔗對根際土壤放線菌和真菌的影響較為復雜，但對根際細菌的影響很小[18]。鄭碧霞（2008）通過跟蹤研究表明：轉(zhuǎn)SrMV-P1基因甘蔗對根際土壤細菌和放線菌存在顯著差異，但對真菌數(shù)量差異不明顯[19]。因此，有人認為可能是由于外源基因蛋白在土壤根際的表達，引起土壤微生物種群的變化[22]。也有人認為，轉(zhuǎn)基因作物對土壤特定微生物產(chǎn)生的顯著影響可能是由轉(zhuǎn)基因植株的形態(tài)學上以及其生理生化特性的改變而引起[22]。但也有一些報道發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因作物對土壤生物不會帶來影響[23]。迄今為止的研究結(jié)果可以看出，抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗對土壤生物群落的影響比較復雜且無規(guī)律可循，不同遺傳背景的轉(zhuǎn)基因甘蔗生長環(huán)境不一樣，皆可能對土壤微生物造成迥異的影響。因此，抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗對土壤微生物種群影響的研究應(yīng)該進行長年的追蹤研究及更深入的探討。

3 抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗基因漂移的研究

所謂基因漂移，是指一種生物的目標基因向附近野生近緣種的自發(fā)轉(zhuǎn)移，導致附近野生近緣種發(fā)生內(nèi)在的基因變化，具有目標基因的一些優(yōu)勢特征，形成新的物種，以致整個生態(tài)環(huán)境發(fā)生結(jié)構(gòu)性的變化?；ǚ蹅鞑ナ寝D(zhuǎn)基因植物的外源基因發(fā)生漂移的主要途徑[24]。甘蔗作為一種無性繁殖作物，通常情況下不易開花，因此，很少存在由于花粉引起的外源基因漂移。但是，外源基因還可以通過重組、復制、轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)位等途徑在微生物之間相互轉(zhuǎn)移，在植物與微生物之間也會自然發(fā)生[25]。Hofmaan等[26]證實了轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因也會水平轉(zhuǎn)移到其它微生物中，轉(zhuǎn)基因油菜、黑芥菜、蒺藜和甜豌豆中抗生素基因可通過轉(zhuǎn)基因植株的根系分泌物轉(zhuǎn)移到一種能與植物共生的黑曲霉微生物中。因此轉(zhuǎn)基因植物也存由于基因的水平轉(zhuǎn)移所帶來的風險。

但是，也有學者認為：外源基因水平轉(zhuǎn)移的可能性是十分小的，理由為：①DNA從植物細胞中釋放出來后，很快被降解成小片段，因此植物DNA進入有腸道微生物存在的小腸下段、盲腸和結(jié)腸前已被降解。②即使有完整的DNA存在，DNA轉(zhuǎn)移整合進入受體細胞并進行表達也是一個非常復雜的過程。目前尚未發(fā)現(xiàn)消化系統(tǒng)中有外源基因轉(zhuǎn)移至腸道微生物的現(xiàn)象。Nielsen等[27]對種植轉(zhuǎn)nptⅡ基因的甜菜的土壤進行測定，發(fā)現(xiàn)在滅過菌的土壤中發(fā)生轉(zhuǎn)化的幾率為1.4×10-8，而在未滅菌的土壤中未檢測到有轉(zhuǎn)化菌株。對種植轉(zhuǎn)nptⅡ基因甜菜的土壤進行測定，并未發(fā)現(xiàn)含有或表達該基因的土壤微生物[28]。周琴等[29]研究也沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因作物中的Bt cry1 Ac10基因向土壤中的細菌、真菌和放線菌轉(zhuǎn)移。因此，在土壤中，基因的水平轉(zhuǎn)移即使發(fā)生，其頻率亦應(yīng)很低。另外需要指出的是，自然土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物豐富多樣，具有強大的緩沖能力，因而人工引入或外來的微生物很難與其競爭；這一事實使得許多土壤微生物學家對轉(zhuǎn)基因植物的基因水平轉(zhuǎn)移問題備感樂觀；但今后隨著新的外源基因的不斷引入和廣泛使用，其所產(chǎn)生的基因流動問題仍需高度關(guān)注[30]。

4 抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗病毒的異源包裝和重組

目前對于轉(zhuǎn)抗病毒作物是否會導致新型病原體的產(chǎn)生，主要有兩方面的安全擔憂：一是病毒的異源包裝或稱轉(zhuǎn)移包裝；二是病毒的異源重組。

4.1 病毒的異源包裝

病毒異源包裝是病毒的基因組被其他病毒的外殼蛋白所包裹，這種現(xiàn)象通常是在植株受多種病毒侵染時發(fā)生。例如，病毒的異源包裝也可能是已經(jīng)轉(zhuǎn)了其他相關(guān)的病毒基因的甘蔗，又轉(zhuǎn)入了CP基因，病毒的基因被CP的外殼蛋白包裹而引起病毒特性的改變。因為CP基因在眾多的因素中對致病性與載體的特異性具有決定性，而使得原先轉(zhuǎn)入其他相關(guān)病毒基因的甘蔗特性有可能發(fā)生改變[10]。這可能會給轉(zhuǎn)基因甘蔗帶來嚴重的危害。目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物中出現(xiàn)病毒的異源包裝已有很多報道[31-33]。

4.2 病毒的異源重組

重組是兩種不同的DNA分子在復制過程中遺傳物質(zhì)的交換。重組也可能發(fā)生在抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗中病毒基因與活性病毒基因的復制過程中。重組后的病毒可能包括轉(zhuǎn)抗病毒基因甘蔗中的抗生素基因和活性病毒基因組片段。因為重組改變了活性病毒的基因組，同時也改變了病毒的相關(guān)性質(zhì)。這些經(jīng)過重組后的病毒可能會給生態(tài)環(huán)境帶來一些負面影響。例如轉(zhuǎn)播媒介的改變、宿主范圍的擴大、以及致病性的增強等等。已有許多研究報道了在轉(zhuǎn)基因植物中出現(xiàn)了病毒的重組[34-39]。

目前，絕大多數(shù)抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗都是通過導入CP基因以及甘蔗花葉病毒上的相關(guān)基因，來提高其抗病性。在提高甘蔗抗病性的同時，也要重視抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗所帶來的一些負面影響。而有關(guān)抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗上的病毒的異源包裝和重組研究少之又少，因此，對這方面的研究應(yīng)該引起足夠的重視。

5 轉(zhuǎn)抗甘蔗花葉病基因甘蔗雜草化的研究

由于雜草難以防除，且對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟損失，所以轉(zhuǎn)基因作物是否會雜草化是評價轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全的一個重要指標。通過基因工程手段插入外源基因，從而使作物可能具有更強的生存競爭能力。并且有些作物（例如甘蔗）本身就具有雜草性，若將它們作為受體材料，可能增加其演變成雜草的概率。但由于甘蔗是經(jīng)過人類長期的馴化培育而成，已基本喪失了雜草的遺傳特性，僅靠一兩個外源基因就使得他們轉(zhuǎn)變成雜草的可能性非常的小[40]，即使抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗在抗花葉病方面比親本具有較大的優(yōu)勢，但一旦當它離開了特定的選擇壓力后，其競爭優(yōu)勢也會立即喪失。并且從目前水稻、玉米、棉花、大豆等轉(zhuǎn)基因植物的田間調(diào)查來看，轉(zhuǎn)基因植物的生存競爭能力并不比非轉(zhuǎn)基因植物強，也沒有演變成農(nóng)田雜草。

但也有一些例子表明轉(zhuǎn)基因植物可能轉(zhuǎn)變成雜草。加拿大轉(zhuǎn)基因油菜在麥田中變成了雜草[41]，且難以治理。而黑麥草、牛筋草、小白酒草、多花黑麥草、香絲草、車前子6種雜草表現(xiàn)出了對草甘膦的抗性，也是由Roundup Ready類轉(zhuǎn)基因作物引起的[42]，說明轉(zhuǎn)基因作物基因漂移到雜草上，導致雜草抗性的產(chǎn)生。

因此通過一些手段來預防轉(zhuǎn)基因作物的雜草化是必要的。主要通過隔離手段和生物手段，前者是制造空間和時間上的距離來防范，后者通過使種子不育、雄性不育、葉綠體母系遺傳、閉花受精和無融合生殖等遺傳學手段來控制[43]。

6 小結(jié)與展望

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的興起，轉(zhuǎn)基因技術(shù)為培育抗花葉病甘蔗育種提供了一條便捷、高效的途徑。同時，也在一定程度上提高了甘蔗的產(chǎn)量和糖分，推動了我國糖料事業(yè)的發(fā)展。但是，抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗與其他轉(zhuǎn)基因植物一樣，可能會帶來一定的生態(tài)風險。目前，我國雖然對抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗生態(tài)安全有一定的研究，但還存在著許多不足。一些問題還具有一定爭議，一些試驗設(shè)計，數(shù)據(jù)處理方法仍存在缺陷，不能確切地評估抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗的生態(tài)風險。在食品安全性的問題方面，只是根據(jù)國外的研究進行推測，目前還沒有確切的研究結(jié)論。而在土壤生態(tài)安全方面，由于土壤的復雜性，目前得出的結(jié)論仍然不具有很強的說服力。在對基因漂移和對病毒異源包裝和重組的研究，還屬于空白。這些問題說明目前在對抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗的研究還存在許多問題。

由于生態(tài)風險是一個主要而又復雜的問題，目前對于抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗以及轉(zhuǎn)基因植物而言，還沒有一個完善的安全評價體系。筆者希望從以下幾個方面進一步改良目前的評價體系：（1）由于甘蔗是一年生作物，對抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗生態(tài)風險評價需要長年定點定植，收集多年的數(shù)據(jù)，觀察多年生態(tài)變化，才能得出確切的結(jié)果；（2）使用合理的試驗設(shè)計，減少其他制約試驗的因素，尤其是對土壤生態(tài)環(huán)境研究方面。因為影響土壤因素太多，往往得出的結(jié)果不夠準確；（3）將數(shù)學建模的思想引入抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗生態(tài)安全的研究中。也許能夠更合理對其生態(tài)安全進行評價，而且該思想已經(jīng)在其他方面環(huán)境評價中得到應(yīng)用。

總之，對抗花葉病轉(zhuǎn)基因甘蔗安全性評價應(yīng)該從多層次、多角度進行研究，然后建立科學的生物安全評價指標體系。

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