張瑩瑩 綜述 周廣東 曹誼林 審校

·綜述·

軟骨組織工程的研究進(jìn)展

張瑩瑩 綜述 周廣東 曹誼林 審校

目前，軟骨組織工程已在基礎(chǔ)研究方面取得了令人矚目的成果，并在臨床應(yīng)用方面進(jìn)行了初步嘗試，為臨床軟骨缺損的修復(fù)提供了新的思路與途徑，已經(jīng)成為該領(lǐng)域主要的研究方向，但其大規(guī)模臨床應(yīng)用尚存在諸多困難?，F(xiàn)結(jié)合近年的研究成果，就組織工程化軟骨的種子細(xì)胞、生物支架材料、體內(nèi)外構(gòu)建以及臨床應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

軟骨組織工程 種子細(xì)胞 支架材料 體內(nèi)外構(gòu)建 臨床修復(fù)

先天性畸形、外傷、腫瘤等造成的軟骨病變或缺損，是整形外科領(lǐng)域常見的疾病。我國每年因軟骨缺損而需進(jìn)行軟骨移植手術(shù)的就超過2 000萬人次。現(xiàn)代外科學(xué)用于修復(fù)病損組織的材料包括異種、同種異體、自體組織和人工合成材料。但是這些材料均具有局限性。

近年來，組織工程學(xué)的發(fā)展為軟骨缺損的修復(fù)提供了新的思路。組織工程學(xué)的基本原理和方法，是將體外擴增的種子細(xì)胞種植于可生物降解、組織相容性好的生物材料，形成復(fù)合物并植入軟骨缺損處，在生物材料自行降解的過程中，種子細(xì)胞形成新的軟骨，以填充缺損[1]。軟骨組織工程研究方面已取得了許多令人矚目的成就。Rotter等[2]將人體軟骨細(xì)胞種植在PLA與PGA的混合物上，移植于裸鼠體內(nèi)，成功地形成了力學(xué)性能穩(wěn)定、密布有微晶管的透明軟骨基質(zhì)；曹誼林等[3]成功再造了具有人耳廓形態(tài)的軟骨組織；Shigeyuki等[4]在膠原凝膠上種植軟骨細(xì)胞，用于修復(fù)大面積關(guān)節(jié)缺損。目前組織工程化軟骨雖然已經(jīng)初步應(yīng)用于臨床，但尚有許多關(guān)鍵問題仍有待于進(jìn)一步的研究。

1 支架材料

支架材料是軟骨組織工程的重要方面，理想的支架材料對于軟骨的構(gòu)造相當(dāng)關(guān)鍵。支架材料分為天然生物材料與合成生物材料。天然生物材料突出的優(yōu)點是其生物相容性好，材料本身就含有特殊的氨基酸序列（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，即RGD序列），能促進(jìn)細(xì)胞與材料的黏附并能維持軟骨細(xì)胞的分化狀態(tài)，軟骨細(xì)胞的生長、代謝好，能產(chǎn)生較多基質(zhì)并形成軟骨[5-6]。但是，天然材料批間差異大，難以大量工業(yè)化生產(chǎn)，限制了其應(yīng)用。人工合成材料具有較強的可控性，可精確控制其形狀、分子量、降解時間、降解率、疏水性等，從而成為組織工程重要的支架材料。聚乳酸（Polylactic acid，PLA）與聚羥基乙酸（Polyglycolic acid，PGA）和二者的共聚物，是當(dāng)前軟骨組織工程應(yīng)用最多的支架材料[7]，可在體內(nèi)水解并逐漸降解、吸收，同時軟骨細(xì)胞合成膠原、蛋白多糖等胞外基質(zhì)替代降解的生物材料，最終生成類似天然軟骨結(jié)構(gòu)的組織。曹誼林等[1]成功地在裸鼠皮下用 PGA-PLA耳型模板構(gòu)建了具有精確三維結(jié)構(gòu)的耳廓狀軟骨，揭示了組織工程技術(shù)應(yīng)用的廣闊前景。該實驗同時也驗證了PLA和PGA能夠加工成具有精細(xì)結(jié)構(gòu)的支架，并用于軟骨細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)[8]。

目前，支架材料的生物相容性、材料與細(xì)胞的親和力、材料的降解速率與組織生成的匹配關(guān)系、降解產(chǎn)物的最終轉(zhuǎn)歸及其對機體的影響、材料的力學(xué)性能等均未得到很好解決，尚需進(jìn)行更為深入的研究。

2 種子細(xì)胞

2.1 自體軟骨細(xì)胞

自體軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞，分化程度高，分泌功能旺盛，不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。但是細(xì)胞來源和增殖能力有限，患者需兩次手術(shù)，治療費用昂貴且治療周期長，使臨床應(yīng)用受到極大制約。

2.2 同種異體或異種軟骨細(xì)胞

與自體細(xì)胞相比，來源廣泛。但對于免疫排斥反應(yīng)目前尚無良好的辦法。

2.3 干細(xì)胞

干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時可無限分裂增殖并保持其多分化潛能，且干細(xì)胞源性的軟骨細(xì)胞具有獲得穩(wěn)定表型等優(yōu)點[10]，體外研究已經(jīng)證實了干細(xì)胞具有軟骨分化潛能。

2.3.1 骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow stem cells，BMSCs）具有增殖能力強，成軟骨分化能力穩(wěn)定，來源廣泛，取材創(chuàng)傷小等優(yōu)勢，已成為軟骨構(gòu)建的首選種子細(xì)胞。骨形成蛋白-2（Bone morphogenetic protein，BMP-2）和胰島素樣生長因子-1（Insulin-like growing factor，IGF-1）是目前兩種已知的具有誘導(dǎo)BMSC向軟骨細(xì)胞分化的細(xì)胞因子。Fukumoto等[11]證實了IGF-1可以誘導(dǎo)從骨膜分離出的MSC向軟骨細(xì)胞分化并顯著地促進(jìn)軟骨形成，而且IGF-1與TGF-B聯(lián)合使用可以極強地增強早期軟骨的生成。

2.3.2 胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ESCs）

主要來源于受精卵發(fā)育成的早期胚胎，也可從體細(xì)胞核移植發(fā)育的胚胎獲得。ESCs是胚胎發(fā)育早期胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中未分化的細(xì)胞，具有以下特點：具有受精卵的多向分化、無限增殖性能；增殖并保持未分化狀態(tài)，具有全能性和形成嵌合體動物的能力；能建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，長期培養(yǎng)可保持高度未分化和發(fā)育潛能。因此，胚胎干細(xì)胞有望成為軟骨組織工程中新的種子細(xì)胞的理想來源。Kramer等[12－13]的研究證實了ESCs在BMP-2及BMP-4作用下可分化為軟骨細(xì)胞。

2.3.3 脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）

Ogawa等[14]將脂肪干細(xì)胞傳代2次后，加入DMEM培養(yǎng)液，應(yīng)用微球培養(yǎng)的方法培養(yǎng)4周，可以檢測到aggrecan和col-Ⅱ、col-Ⅹ等基因表達(dá)，組織學(xué)染色可以發(fā)現(xiàn)阿麗辛藍(lán)染色陽性細(xì)胞，這些都證明脂肪干細(xì)胞可以向軟骨細(xì)胞分化。因ADSCs來源充足、獲取方便、對培養(yǎng)基的要求低、體外擴增能力強等優(yōu)點，已引起了學(xué)界的廣泛關(guān)注。

2.3.4 其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞

Wakitani等[15]培養(yǎng)兔脛骨膜細(xì)胞，修復(fù)兔股骨髁全層軟骨缺損，24周時軟骨下骨完全形成，新生軟骨組織無骨化現(xiàn)象。Fuchs等[16]以羊臍血干細(xì)胞構(gòu)建出了與天然軟骨具有相似組織學(xué)特性的三維軟骨。

3 體內(nèi)、外構(gòu)建

按培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞所處的空間結(jié)構(gòu)分為單層培養(yǎng)和三維立體培養(yǎng)。單層培養(yǎng)是目前軟骨細(xì)胞主要的培養(yǎng)方式，經(jīng)過5～6次傳代后，軟骨細(xì)胞逐漸由三角形、多角形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形，喪失軟骨細(xì)胞的標(biāo)志性表型Ⅱ型膠原蛋白，此過程稱之為去分化。以往研究發(fā)現(xiàn)，單層培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在培養(yǎng)過程中逐漸失去了典型軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，類似于成纖維細(xì)胞，而且Ⅱ型膠原分泌減少，失去了軟骨細(xì)胞特異性，即出現(xiàn)了反分化。三維支架設(shè)計的最初目的也正是希望模擬細(xì)胞外基質(zhì)的功能，為細(xì)胞提供分化信號，同時通過細(xì)胞與支架的黏附生長以保證單位空間的細(xì)胞密度，促進(jìn)細(xì)胞的集聚，進(jìn)而促進(jìn)培養(yǎng)過程中細(xì)胞間通訊以維持其分化特性，并且還可以通過改變支架的特性引導(dǎo)體外培育的組織形成特定形狀，以適應(yīng)外科植入的需求。藻酸鹽凝膠三維培養(yǎng)能使軟骨細(xì)胞的表型維持達(dá)8個月之久，并能使去分化的軟骨細(xì)胞再分化，Ⅱ型膠原重新表達(dá)，解離也相當(dāng)方便。在三維立體環(huán)境下，軟骨細(xì)胞的表型穩(wěn)定，且更適合軟骨細(xì)胞的生長、代謝，明顯優(yōu)于單層培養(yǎng)。Kuriwaka等[17]將三維培養(yǎng)和單層培養(yǎng)結(jié)合起來，希望在保證軟骨細(xì)胞分化程度的前提下最大限度地擴增細(xì)胞數(shù)量。他們認(rèn)為，除了模擬體內(nèi)細(xì)胞在三維空間中生長的條件外，更重要的是為其提供充足的營養(yǎng)、氧氣和適宜的物理和化學(xué)信號以及有效地排出細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，以促進(jìn)并維持軟骨細(xì)胞的分化表型。

生物反應(yīng)器綜合了連續(xù)灌注培養(yǎng)與應(yīng)力刺激培養(yǎng)，培養(yǎng)液可循環(huán)流動，并且具有一定的切應(yīng)力，促進(jìn)了三維支架上的軟骨細(xì)胞生長。生物反應(yīng)器的優(yōu)點：①軟骨產(chǎn)量較高，這樣就能用相同的種植細(xì)胞量生產(chǎn)出更多的軟骨；②良好的細(xì)胞貼附動力學(xué)及細(xì)胞的高切應(yīng)力敏感性；③具有較好的軟骨細(xì)胞空間分布一致性。在生物反應(yīng)器內(nèi)，培養(yǎng)液的循環(huán)流動加上轉(zhuǎn)動培養(yǎng)，有助于直徑為20～32 nm的軟骨細(xì)胞聚合體形成，從而提高細(xì)胞的貼附能力，使細(xì)胞分布更趨一致。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，旋轉(zhuǎn)的生物反應(yīng)器具有提高軟骨生長和機械性能的作用。

體外培養(yǎng)一段時間后，將構(gòu)建的組織工程化軟骨植入體內(nèi)，能夠得到更加成熟，更趨于天然軟骨的構(gòu)建組織。這可能與體內(nèi)的生理微環(huán)境所提供的適宜氧濃度，以及外周血供有關(guān)。同時，體內(nèi)植入也能夠很好的檢驗體外構(gòu)建組織的穩(wěn)定性。Wakitani等[18－19]先后證實了動物的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合生物支架材料，可以有效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，而且BMSCs還可以在不同的關(guān)節(jié)微環(huán)境中分別分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。但是對于很多發(fā)生在皮下的軟骨缺損（如耳、鼻的軟骨缺損），動物實驗證明皮下環(huán)境不適合BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，因此植入體內(nèi)后的微生態(tài)對構(gòu)建組織的存活和發(fā)揮生理功能具有非常重要的作用[20－21]。周廣東等[22-23]嘗試用豬和人的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）在體外分別進(jìn)行短時間誘導(dǎo)培養(yǎng)和長時間充分的誘導(dǎo)，再植入皮下進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)體外誘導(dǎo)時間短（4～8周）的軟骨植入后易發(fā)生血管化，形成骨樣或纖維樣血管化組織；而通過體外12周左右的靜態(tài)誘導(dǎo)和培養(yǎng)，可以構(gòu)建出具有一定形態(tài)的組織工程化軟骨組織，移植入裸鼠皮下后發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的軟骨組織可以長期存活，但是不能完全保持原來的形態(tài)，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)構(gòu)建軟骨細(xì)胞數(shù)量減少而且發(fā)生不同程度的鈣化，而這種鈣化可能是部分軟骨發(fā)生血管化后再骨化的結(jié)果[24]，也可能是經(jīng)過體外長期培養(yǎng)和誘導(dǎo)后BMSCs發(fā)生老化凋亡的結(jié)果。因此，如何抑制組織工程化軟骨植入體內(nèi)非軟骨環(huán)境后產(chǎn)生的血管化，同時縮短組織工程化軟骨體外培養(yǎng)和構(gòu)建的時間，是當(dāng)前亟待解決的問題。

4 臨床應(yīng)用研究

軟骨缺損是臨床常見的疑難病癥之一。由于軟骨的再生能力低而難以自行修復(fù)，目前臨床上多采用自體或異體軟骨移植、軟骨膜或骨膜移植、軟骨細(xì)胞移植等方法進(jìn)行修復(fù)，但均因取材局限、免疫排斥等導(dǎo)致效果不佳。利用組織工程的方法再造軟骨，為軟骨缺損的臨床修復(fù)提供了新的思路與途徑。目前，國外已開展組織工程修復(fù)臨床軟骨缺損的初步探索，但仍缺乏大樣本及長期隨訪研究，對臨床應(yīng)用發(fā)生的不良反應(yīng)亦鮮有報道，對治療效果的評估尚無統(tǒng)一的客觀標(biāo)準(zhǔn)，但上述研究依然為軟骨組織工程的臨床大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4.1 關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)方面

隨著軟骨組織工程基礎(chǔ)研究的迅速發(fā)展，組織工程化軟骨的臨床應(yīng)用研究也取得了一定的成果。Pavesio等[25]采用自體軟骨細(xì)胞體外擴增后，種植至透明質(zhì)酸內(nèi)，治療600例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者。67例進(jìn)行了術(shù)后關(guān)節(jié)鏡和組織學(xué)檢查。結(jié)果表明，97%的患者主觀評價滿意，94%的患者生活質(zhì)量提高。膝關(guān)節(jié)功能檢查顯示，87%的患者功能恢復(fù)良好；關(guān)節(jié)鏡檢查顯示，96.7%的患者關(guān)節(jié)軟骨具有良好生物學(xué)形態(tài)；組織學(xué)證實大多為透明樣軟骨。Visna等[26]在2000年至2002年期間，采用體外培養(yǎng)的自體軟骨細(xì)胞和纖維蛋白凝膠治療了19例膝關(guān)節(jié)深層軟骨缺損的患者，并對14例缺損（2～10 cm，平均4.31 cm）患者中的12例進(jìn)行了評估。術(shù)后5～12個月隨訪顯示，12例患者的臨床癥狀得到改善，Lysholm膝關(guān)節(jié)功能評分從術(shù)前的45.6提高到術(shù)后5個月時的72.0和術(shù)后12個月時的81.5；關(guān)節(jié)鏡活檢顯示，可見典型的球形軟骨細(xì)胞，退化區(qū)新生血管形成，可見成纖維細(xì)胞。

4.2 修復(fù)重建外科方面

Cherubino等[27]從1999年11月至2001年1月，采用患者自體軟骨細(xì)胞及雙層膠原膜三維支架，對13例軟骨損傷的患者進(jìn)行了修復(fù)治療，術(shù)后隨訪2～15個月 （平均6．5個月），未觀察到并發(fā)癥，其中6例術(shù)后6個月臨床癥狀和關(guān)節(jié)功能改善，磁共振影像顯示移植部位有透明樣軟骨存在，關(guān)節(jié)鏡活檢也顯示在移植表層可見成軟骨細(xì)胞。Wakitani等[28]將患者自體骨髓干細(xì)胞種植至膠原凝膠上再移植，并用自體骨膜覆蓋，治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的1例26歲女性患者和1例44歲男性患者。移植后6個月，臨床癥狀明顯改善并有效保持。該女性患者2年、男性患者1年后，關(guān)節(jié)鏡檢查顯示損傷部位纖維軟骨修復(fù)。

4.3 氣管軟骨修復(fù)方面

2004年，Long等[29]將同種異體軟骨細(xì)胞－PLA復(fù)合物在動物體內(nèi)培養(yǎng)7周后行氣管修補術(shù)，纖維喉鏡下觀察實驗組2只動物。術(shù)后第4周可見氣管管腔通暢，移植組織存活，氣管切緣縫合處略水腫，有1只動物創(chuàng)緣可見肉芽組織生長。第6周和第8周檢查見氣管管腔通暢，無明顯狹窄，移植物與氣管切緣愈合良好，縫合處水腫逐漸減輕，肉芽組織逐漸消失。修補術(shù)后組織學(xué)觀察顯示，手術(shù)后第8周，移植處軟骨組織內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤，可見大量軟骨細(xì)胞及其基質(zhì)，管腔一側(cè)為纖維組織；行阿爾辛蘭-麗春紅染色，移植處組織標(biāo)本內(nèi)可見大量染色呈綠色的軟骨細(xì)胞。2008年，首例應(yīng)用干細(xì)胞方法培養(yǎng)的“人造氣管”移植成功?！读~刀》、《新科學(xué)家》報道，一支由多國科研人員組成的醫(yī)療團(tuán)隊在西班牙完成了全球首例“人造氣管”暨完整的“人造器官”移植手術(shù)，術(shù)后30歲女患者已徹底康復(fù)。手術(shù)共分5個步驟完成。提取捐贈氣管行脫細(xì)胞處理，將患者自身干細(xì)胞注入“支架”，然后培養(yǎng)“新氣管”，壞死氣管切除，最后移植“新氣管”[30]。

4.4 組織工程化軟骨臨床應(yīng)用面臨的困難

4.4.1 種子細(xì)胞的獲取和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)流程的建立和規(guī)范

包括體外細(xì)胞培養(yǎng)、干細(xì)胞誘導(dǎo)分化、組織構(gòu)建和支架降解等的最適宜時間等還需進(jìn)一步研究。

4.4.2 仿生化、智能化軟骨組織工程生物材料的制備

從群體化治療考慮，工程化制備組織工程軟骨，應(yīng)當(dāng)選用同種異體種子細(xì)胞。但是，同種異體細(xì)胞的抗原性以及臨床使用的安全性尚沒有解決辦法。另外，能完全滿足組織工程要求的三維載體材料的更為深入的研究，還有待于相關(guān)學(xué)科的共同努力。

4.4.3 組織工程軟骨臨床應(yīng)用所面臨的倫理及安全性問題

組織工程化軟骨在種子細(xì)胞培養(yǎng)和組織構(gòu)建時需使用血清和大量的細(xì)胞因子，尚存在一些醫(yī)學(xué)倫理問題有待解決。另外，目前尚無臨床應(yīng)用實驗后的長期隨訪結(jié)果，組織工程化組織在體內(nèi)的長期存在，是否會導(dǎo)致不利的后果仍存在一定的疑問[31-32]

組織工程產(chǎn)品和臨床應(yīng)用安全性評價與標(biāo)準(zhǔn)化是組織工程臨床應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化必經(jīng)的重要階段，目前從總體上看國內(nèi)外對組織工程產(chǎn)品尚無完善的、整體的管理辦法及評價方法，嚴(yán)重制約了組織工程產(chǎn)品的臨床應(yīng)用與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。組織工程的特點（細(xì)胞、材料與臨床應(yīng)用的緊密結(jié)合）決定了它不可能僅局限于現(xiàn)有的任何一個安全性評價體系內(nèi)，必須建立專有的評價指標(biāo)和評價流程。

5 展望

隨著軟骨組織工程研究的不斷深入，以及前期臨床應(yīng)用實驗的長期觀察結(jié)果，種子細(xì)胞篩選、培養(yǎng)和組織構(gòu)建的規(guī)范化，以及安全性評價體系的建立將是今后的研究重點。當(dāng)這些問題得到了充分的研究，以及相關(guān)倫理問題得到解決，組織工程化軟骨將真正應(yīng)用于臨床，并能解決眾多的臨床醫(yī)學(xué)難題，而造福于人類。

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Research Progress of Cartilage Tissue Engineering

ZHANG Yingying,ZHOU Guangdong,CAO Yilin.

Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHOU Guangdong(E-mail:guangdongzhou@126.com).

【Summary】At present,cartilage tissue engineering has made resounding achievements in basic research,and has been applied to preliminary clinical practice which showed a promising approach for repair of cartilage defect.However,as to clinical application in the future,many difficulties remained.This review covered both the current situation of the research development in cartilage tissue engineering (seeding cells,bio-scaffolds,in vitro and in vivo construction)and the obstacles of its clinical application．

Cartilage tissue engineering; Seeding cells;Bio-scaffolds; In vitro and in vivo construction; Clinical repair

Q813.1+2

B

1673－0364（2011）06－0340－04

2011年8月4日；

2011年9月12日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.06.013

國家自然科學(xué)基金項目 （30772264,50830105, 30973131）；上海市曙光計劃項目（08SG19）；上海市啟明星計劃跟蹤項目（09QH1401600）。

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

周廣東（E-mail:guangdongzhou@126.com）。