曾 蓉 陳 燕 崔國惠

(華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液病研究所,湖北武漢 430022)

冬凌草甲素 (oridonin,Ori),為一類雙萜類化合物,提取自碎米椏植物中,具有多種藥理和生理作用,例如抗炎和抗菌作用等,其在抗腫瘤方面的作用研究逐漸成為熱點(diǎn)[1-3]。至今為止,一些體內(nèi)外實驗均證實冬凌草甲素可以誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬[4-6],但是關(guān)于兩者之間的關(guān)系、兩者對腫瘤細(xì)胞生存的影響以及涉及的分子機(jī)制研究才剛剛起步。

自噬是一通過溶酶體分解胞質(zhì)成分的過程,主要有3種形式的自噬:巨自噬(以下簡稱自噬);微自噬以及伴侶分子介導(dǎo)的自噬。自噬由一系列連續(xù)步驟完成,以自噬小體的形成為特征[7,8]。隨著各種自噬相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn),自噬的分子過程也逐漸清晰,在眾多的自噬相關(guān)基因中最為重要的基因包括Beclin1和LC3。Beclin1為Atg6的同源類似物,介導(dǎo)自噬起始[9-11]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3),為Apg8p的同源類似物,其在自噬小體膜形成中至關(guān)重要。LC3具有兩種形式-LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ主要以彌漫的形式位于胞漿中,當(dāng)自噬發(fā)生時,被處理為LC3-Ⅱ并參與構(gòu)成自噬小體膜,在細(xì)胞內(nèi)以點(diǎn)簇狀形式存在,因此Beclin1的蛋白表達(dá)水平以及LC3-Ⅱ自噬小體膜定位通常用來作為判斷自噬水平的指標(biāo)[9-11]。凋亡——程序性細(xì)胞死亡Ⅰ型(PCDⅠ),是一種受基因調(diào)控的細(xì)胞自殺過程,其形態(tài)學(xué)特征為核膜周邊染色質(zhì)凝集、核凝集、細(xì)胞器保留比較完整以及吞噬小體的缺失。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是一類生存周期短、具有活性的含氧化合物,主要包括超氧陰離子、氧自由基、過氧化合物等。雖然在線粒體在正常氧化呼吸時也不可避免的產(chǎn)生少量的ROS,在生理狀態(tài)下低水平的ROS能被一些抗氧化酶和物質(zhì)降解,然而中、高度的ROS產(chǎn)生導(dǎo)致ROS胞內(nèi)蓄積從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。ROS能直接氧化蛋白、脂質(zhì)以及DNA引起一系列細(xì)胞反應(yīng)。大量研究已經(jīng)證實ROS產(chǎn)生通過增加線粒體膜通透性直接啟動凋亡[12,13]。

本實驗研究了冬凌草甲素作用于多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞誘發(fā)自噬和凋亡,兩者之間的關(guān)系以及ROS的作用。

材料和方法

1.材 料

人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞購自ATCC;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、冬凌草甲素、3-甲基腺素(3-MA)、NAC(N-Acetyl-L-cysteine,N-乙酰-L-半胱氨酸)、DCFH-DA(2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽)熒光探針、抗人單克隆抗體γ-tubulin購自美國Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)液購自美國 Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;凋亡試劑盒(TUNEL)購自博士德生物有限公司;抗人單克隆抗體LC3購自美國Abcam公司;抗人多克隆抗體Beclin1購自美國Santa cruz公司。

2.方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞到達(dá)對數(shù)生長期后,用相應(yīng)濃度的Ori處理細(xì)胞。Ori處理前1h加入5m mol/l NAC預(yù)處理,用以抑制胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。Ori處理前1h加入5m mol/l 3-MA預(yù)處理,用以抑制自噬。

2.2 MTT比色實驗

用含10%胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基將RPMI8226細(xì)胞配成單個細(xì)胞懸液,以每孔1×105/ml的濃度接種于96孔板中,每孔體積200μl。將接種細(xì)胞的96孔板置于CO2培養(yǎng)箱中,以37℃、5%CO2、飽和濕度分別培養(yǎng)12h、24h和48h,Ori的工作濃度分別為 1、2、4、8、16、32、64μmol/l。細(xì)胞經(jīng)實驗處理后,每孔加入20μlMTT溶液(5 mg/ml),繼續(xù)于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育4h。結(jié)束后,平板離心機(jī)以1000rpm轉(zhuǎn)速離心5min,小心吸棄上清,于每孔中加入150μl DMSO,振蕩并充分溶解結(jié)晶15min。選擇激發(fā)波長490nm,參考波長650nm,在 ELX800型酶標(biāo)儀上分析各孔光密度(OD)值,并記錄計算細(xì)胞增殖抑制率:(對照組OD值–對照調(diào)零組OD值)– (實驗組OD值– 實驗調(diào)零組OD值)/(對照組OD值–對照調(diào)零組OD值)×100。

2.3 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡

收集經(jīng)10μmol/l Ori處理24h的細(xì)胞,并以未經(jīng)Ori處理的細(xì)胞作為對照,根據(jù)使用說明進(jìn)行實驗。在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實驗結(jié)果,顯微鏡下共計數(shù)500個細(xì)胞,計算調(diào)亡率:凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%

2.4 利用QDs605nm-Anti-LC3熒光探針免疫熒光定位LC3

(1)QDs605nm-Anti-LC3熒光探針制備:根據(jù)武漢大學(xué)化學(xué)和生物分子學(xué)院提供的步驟進(jìn)行熒光探針制備[14]。簡要步驟如下:用巰基乙酸活化過的QDs605nm溶解于含50 mmol N-(3-二甲基胺基丙基)-N’-乙基碳二亞胺 氯化氫和5 mmol N-羥基丁二酰亞胺的 PBS中;接著于20μl抗人LC3單克隆抗體在室溫下振蕩孵育2-4h;6000g室溫離心10分,獲取上清并微孔透析 8-12h獲得較純的QD605nm-Anti-LC3探針,4℃保存。

(2)免疫熒光反應(yīng):收集經(jīng)實驗處理后的細(xì)胞,PBS洗滌2次,4%多聚甲醛4℃固定1h;PBS洗滌2次,將細(xì)胞涂于經(jīng)1%明膠預(yù)先包被過的載玻片上,在超凈工作臺上干燥制片;用0.1%Triton X-100滴于載玻片細(xì)胞面,在室溫下破膜10分;接著將終濃度為 1×10-7mol/l的 QD605nm-Anti-LC3探針溶液滴加在載玻片細(xì)胞面,室溫孵育4h;PBS洗3次,封片。

(3)熒光顯微鏡下觀察:以605nm激發(fā)波長觀察,LC3-Ⅰ在胞漿內(nèi)彌散分布,LC3-Ⅱ呈點(diǎn)簇狀分布,故紅色的斑點(diǎn)狀熒光表示LC3-Ⅱ的自噬小體膜定位。至少計數(shù)500個細(xì)胞并計算紅色斑點(diǎn)狀熒光陽性細(xì)胞率%:紅色斑點(diǎn)狀熒光陽性細(xì)胞率%=紅色斑點(diǎn)狀熒光陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100。

2.5 免疫印記實驗

利用western blot檢測細(xì)胞Beclin1蛋白水平,收集經(jīng)實驗處理的細(xì)胞,用預(yù)冷的 PBS洗滌2次,然后重懸于細(xì)胞裂解液,于冰上裂解30min,期間超聲裂解 3次,裂解后在 4℃以 12000rpm離心15min,收集上清即總蛋白質(zhì)液。用BCA法測定蛋白濃度后,用5×上樣緩沖液(終濃度為1×)和雙蒸水稀釋各蛋白樣品至同一濃度備用。取等量的蛋白樣品進(jìn)行 SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育等步驟后,用 ECL孵育后,X光膠片曝光,曝光顯影的目的條帶用ImageJ image處理軟件進(jìn)行半定量分析,以內(nèi)參為參考標(biāo)準(zhǔn)計算出目的條帶標(biāo)準(zhǔn)化后的光密度值,并以此判斷蛋白的表達(dá)水平。

2.6 測量胞內(nèi)ROS產(chǎn)生

收集經(jīng)實驗處理后的細(xì)胞,RPMI1640洗滌2次。細(xì)胞重懸于終濃度為25μmol/L DCFH-DA溶液中,輕輕吹打混勻,37℃孵育30min。DCFH-DA探針裝備完成后,用 RPMI1640培養(yǎng) 洗滌細(xì)胞2次,用流式細(xì)胞術(shù)以激發(fā)波長488nm,用一波長為515 nm的通帶濾器檢測DCF熒光。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0做統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗,P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.冬 凌草甲素抑制RPMI8226細(xì)胞增殖

分別以 1、2、4、8、16、32 umol/L 的 Ori作用于RPMI8226細(xì)胞12h、24h和48h。根據(jù)MTT分析,如圖1所示,Ori能明顯抑制細(xì)胞增殖,其細(xì)胞增殖抑制作用呈時間-、劑量-依賴性,其48h的 IC50為5.16μmol/L。

圖1 Ori對RPMI8226細(xì)胞增殖抑制作用的時效、量效分析不同濃度的 Ori(1、2、4、8、16、32u mol/L)分別作用 RPMI8226細(xì)胞12h,24h和48h。Fig.1 Assessment of time-and dose-effect of proliferative inhibition induced by Ori in RPMI8226 cellsRPMI8226 cells were treated with Ori at various concentrations(1,2,4,8,16,32u mol/L)for 12h,24h and 48h.

2.冬 凌草甲素通過胞內(nèi)ROS產(chǎn)生誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞凋亡

利用TUNEL和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測10μmol/L Ori作用0h,24h后RPMI8226細(xì)胞凋亡和胞內(nèi)ROS水平。如圖2a所示,與0h相比,Ori處理24h后TUNEL陽性細(xì)胞顯著增多,計算凋亡率為58.91±3.43%,明顯高于0h(6.01±0.62%,P<0.01),表明Ori誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如圖2b所示,隨著凋亡的增加,胞內(nèi)ROS產(chǎn)生,24h細(xì)胞DCF平均熒光強(qiáng)度明顯高于0h(41018.27±392.71 versus 26853.33±587.44,P<0.01)。

為了進(jìn)一步探討胞內(nèi)ROS產(chǎn)生在Ori誘導(dǎo)凋亡過程中的作用,用5 mmol/L自由基清除劑NAC預(yù)處理細(xì)胞1h,然后Ori作用24h,重復(fù)上述實驗檢測胞內(nèi)ROS水平和凋亡并與Ori處理組比較。如圖2b所示,與Ori處理組相比,NAC預(yù)處理組DCF平均熒光強(qiáng)度明顯下降至基礎(chǔ)水平(25899.81±601.71),NAC完全抑制了Ori導(dǎo)致的胞內(nèi)ROS產(chǎn)生,同時細(xì)胞凋亡消失(5.93±1.13%)(見圖2a)。

以上結(jié)果說明胞內(nèi)ROS產(chǎn)生對Ori誘導(dǎo)凋亡至關(guān)重要,換言之,Ori通過胞內(nèi)ROS產(chǎn)生誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.冬 凌草甲素誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞自噬

利用QDs605nm-Anti-LC3熒光探針免疫熒光技術(shù)和western blot分別檢測 RPMI8226細(xì)胞經(jīng)10μmol/L Ori處理0h,24h的LC3胞內(nèi)定位和Beclin1蛋白水平。如圖3a所示,與0h相比,Ori作用24h紅色點(diǎn)簇狀熒光陽性細(xì)胞明顯增多,且紅色點(diǎn)簇狀熒光細(xì)胞陽性率也顯著升高(89.67±4.65%versus 14.13±3.05%)。Western blot檢測分析Beclin1的蛋白水平發(fā)現(xiàn)24h蛋白水平明顯高于0h(見圖3b)。以上結(jié)果說明Ori除了誘導(dǎo)凋亡外還能同時誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

圖2 Ori處理組、NAC預(yù)處理組和3-MA預(yù)處理組凋亡和胞內(nèi)ROS產(chǎn)生變化RPMI8226細(xì)胞分別以10μmol/L Ori處理0h和24h、先以5m mol/L NAC或5m mol/L 3-MA預(yù)處理1h后經(jīng)10μmol/L Ori處理 24h。(a)TUNEL檢測細(xì)胞凋亡;(b)流式細(xì)胞術(shù)分析DCF熒光強(qiáng)度。直方圖中的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D,n=3)表示 ,＊P<0.05,＊＊P<0.01。Fig.2 Assessment of intracellular ROS level in Ori-treated,NAC-pretreated and 3-MA-pretreated groupsRPMI8226 cells were pre-treated with 5m mol/L 3-MA or NAC for 1h,and then treated with 10u mol/L Ori for 24h.Cells were alone-treated with 10μmol/L Ori for 0h and 24h.(a)apoptosis detected by TUNEL;(b)DCF fluorescent intensity analyzed by FCM.Columns,mean of three independent experiments;Error bars,±S.D;＊P<0.05,＊＊P<0.01

圖3 Ori處理組和3-MA預(yù)處理組自噬變化

圖3 b western blot檢測Beclin蛋白水平并以γ-tubulin作為內(nèi)參應(yīng)用ImageJ image處理軟件進(jìn)行半定量分析。直方圖中的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.,n=3)表示,＊＊P<0.01,＊P<0.05(b) Beclin1 protein levels were detected by western blot assay.γ-tubulin was used as an equal loading control.The bands were quantified by ImageJ image software.Columns,mean of three independent experiments;Error bars,±S.D.;＊P<0.05,＊＊P<0.01

4.在RPMI8226細(xì)胞中,胞內(nèi)ROS產(chǎn)生參與了抑制自噬上調(diào)促進(jìn)冬凌草甲素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程

以上的實驗結(jié)果已經(jīng)說明凋亡是Ori所致的細(xì)胞死亡的途徑之一,為了進(jìn)一步探討自噬在細(xì)胞死亡中充當(dāng)?shù)慕巧?以及自噬和凋亡之間的關(guān)系,自噬抑制劑3-MA引入了實驗研究,細(xì)胞先經(jīng)5 mmol/L 3-MA預(yù)處理1h,然后10μmol/L Ori作用24h。重復(fù)上述實驗檢測自噬、凋亡和胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。如圖3a,b所示,3-MA預(yù)處理組紅色點(diǎn)簇狀熒光細(xì)胞陽性率(39.87±2.93%)以及Beclin1蛋白水平明顯低于Ori處理組(P<0.01)。如圖2a,b所示,3-MA預(yù)處理組調(diào)亡率(81.33±4.83%)和DCF平均熒光強(qiáng)度(59811.37±322.16)均明顯高于Ori處理組(P<0.05)。

上述結(jié)果表明自噬并非細(xì)胞死亡的途徑而充當(dāng)細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。抑制自噬通過上調(diào)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生促進(jìn)Ori誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

討 論

冬凌草甲素,一種潛在的抗腫瘤藥物,已經(jīng)證實在多種腫瘤細(xì)胞系中同時誘發(fā)自噬和凋亡,包括Hela細(xì)胞、A431細(xì)胞等[5,15]。自噬和凋亡之間的關(guān)系研究結(jié)果說法不一,普遍認(rèn)為在不同的細(xì)胞中、不同的條件下,兩者之間的關(guān)系也隨之不同。Jia等人發(fā)現(xiàn)自噬對 TNF-α誘發(fā) T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡至關(guān)重要,凋亡的發(fā)生依賴于自噬的發(fā)生[16]。在另外的實驗體系中,發(fā)現(xiàn)自噬拮抗或延緩凋亡,通過抑制自噬可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15,17]。在本實驗中,同樣發(fā)現(xiàn)Ori同時誘發(fā)RPMI8226細(xì)胞凋亡和自噬,利用公認(rèn)的自噬抑制劑3-MA抑制自噬后,發(fā)現(xiàn)Ori誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加,說明雖然Ori同時誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬和凋亡,但自噬抑制細(xì)胞凋亡,為細(xì)胞促生存機(jī)制,凋亡才是細(xì)胞死亡的主要途徑。

胞內(nèi)ROS產(chǎn)生介導(dǎo)很多細(xì)胞生理和病理反應(yīng),高水平的ROS與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。ROS參與凋亡作用已經(jīng)被大量的研究證實[12,13]。在本實驗中,Ori同時誘發(fā)胞內(nèi) ROS產(chǎn)生和凋亡,用NAC完全抑制胞內(nèi)ROS后,凋亡也不能再被誘導(dǎo),說明在此Ori誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是經(jīng) ROS介導(dǎo)的,且胞內(nèi) ROS產(chǎn)生是Ori誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵機(jī)制。有研究表明自噬能有效緩解胞內(nèi)ROS產(chǎn)生緩解應(yīng)激壓力發(fā)揮其促生存作用[20-21],在本研究中,利用3-MA抑制自噬后,細(xì)胞凋亡增加的同時胞內(nèi)ROS水平也隨之進(jìn)一步升高,說明胞內(nèi)ROS產(chǎn)生參與了抑制自噬促進(jìn)Ori誘導(dǎo)的凋亡的過程。以上發(fā)現(xiàn)為深入研究Ori治療多發(fā)性骨髓瘤的分子機(jī)制、靶點(diǎn)提供了新的契機(jī)。

綜上所述,在本實驗中發(fā)現(xiàn)Ori同時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬;胞內(nèi)ROS產(chǎn)生是Ori誘發(fā)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵機(jī)制;闡明自噬通過緩和胞內(nèi)ROS產(chǎn)生拮抗凋亡,為促進(jìn)Ori抗腫瘤療效提供了一個可行的方案。以上研究結(jié)果提供有關(guān)Ori誘導(dǎo)凋亡和自噬機(jī)制的新信息,為MM的治療提供新思路。

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