申繼清，王啟輝，葉潔梅，王 健，冷 靜*

(1廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧530021;2廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心; 3廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

狂犬病是迄今為止人類(lèi)致死率最高的可防不可治的急性傳染病，預(yù)防與控制的惟一有效措施是接種狂犬病疫苗。目前使用的狂犬病疫苗大多為液體(含鋁佐劑)和凍干(無(wú)佐劑)的純化Vero細(xì)胞疫苗，其中鋁佐劑可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生抗體遲緩、細(xì)胞免疫抑制，且液體疫苗穩(wěn)定性差［1］;而凍干純化Vero細(xì)胞疫苗雖然純度高、穩(wěn)定性好、毒副反應(yīng)少、免疫后抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率較高，但需免疫5次、疫苗免疫原性低，且單獨(dú)用疫苗接種后抗體產(chǎn)生較遲、維持時(shí)間短［2］。冷靜等［3，4］、Leng等［5］及王健等［6］研究顯示，成團(tuán)泛菌脂多糖(LPSp)對(duì)乙肝表面抗原及純狂犬病毒蛋白疫苗均有明顯佐劑效應(yīng)，且安全、活性高，但對(duì)含鋁佐劑狂犬病疫苗佐劑效應(yīng)不明顯。2009年7月，我們觀察了LPSp對(duì)小鼠不同免疫方案中狂犬病毒抗原免疫效果的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性Balb/c小鼠128只，6～8周齡，體質(zhì)量18～23 g(廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);LPSp，質(zhì)量濃度為2 mg/ml;狂犬病疫苗(含氫氧化鋁)，本教研室自制，抗原含量為2.5 IU/ml;狂犬病毒蛋白，抗原含量為2.5 IU/ml;羊抗小鼠IgG單克隆抗體，AP標(biāo)記;羊抗小鼠IgM單克隆抗體，AP標(biāo)記;抗狂犬病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清。

1.2 動(dòng)物分組及處理 將120只Balb/c小鼠隨機(jī)分為空白組、LPSp對(duì)照組、鋁佐劑疫苗組、狂犬病毒蛋白組、LPSp實(shí)驗(yàn)組各24只，其中后四組分別背部注射LPSp、鋁佐劑疫苗、狂犬病毒蛋白及狂犬病毒蛋白+LPSp進(jìn)行1(第0天)、2(第0、15天)、4次(第0、7、15、21天)免疫(各8只)，狂犬病毒蛋白用量均為每只0.5 IU、LPSp用量為每只10 μg，用時(shí)以生理鹽水配制為0.2 ml;空白組注射等量生理鹽水。另取8只小鼠為常規(guī)組，按鋁佐劑疫苗組免疫4次，并于第28天行第5次免疫。

1.3 血清抗狂犬病毒抗體檢測(cè) 各組分別在初次免疫后第7、14、21、30、45、60天經(jīng)眼內(nèi)眥靜脈取血，分離血清，采用間接ELISA法檢測(cè)血清抗狂犬病毒抗體。以未免疫小鼠血清作為陰性對(duì)照，以10 μg/ml純狂犬病毒蛋白包被96孔酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜，洗滌后用0.2%Gelatin于37℃溫箱封閉2 h，洗滌后加入倍比稀釋的待檢血清，每孔50 μl，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，37℃溫育1 h;洗滌后加AP標(biāo)記的羊抗小鼠1 g，每孔50 μl(空白對(duì)照不加)，37℃溫育1 h，充分洗滌后每孔加100 μl p-NPP底物反應(yīng)液，37℃避光顯色30 min，每孔加2 N NaOH溶液50 μl終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取每孔OD405值?？贵w最高稀釋度計(jì)算以檢測(cè)值/陰性對(duì)照值(P/N)≥2.1判定，實(shí)驗(yàn)測(cè)定值取組內(nèi)小鼠測(cè)定值的幾何平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)經(jīng)變量轉(zhuǎn)換(取對(duì)數(shù))后以ˉx ±s表示，兩兩比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié)果

2.1 抗狂犬病毒IgG抗體滴度 空白組和LPS對(duì)照組不同時(shí)間抗狂犬病毒IgG抗體滴度均＜2;其余四組不同時(shí)間抗狂犬病毒IgG抗體滴度見(jiàn)表1。

2.2 抗狂犬病毒IgM抗體滴度 LPSp實(shí)驗(yàn)組在一次免疫后第7天IgM抗體滴度顯著高于狂犬病毒蛋白組與鋁佐劑疫苗組(P均＜0.05)，第7天后IgM抗體滴度下降，但2、4次免疫時(shí)又出現(xiàn)以上趨勢(shì)。

表1 四組不同時(shí)間抗狂犬病毒IgG抗體滴度(n=8，±s)

表1 四組不同時(shí)間抗狂犬病毒IgG抗體滴度(n=8，±s)

注:與同免疫次數(shù)、同時(shí)間狂犬病毒蛋白組及鋁佐劑疫苗組比較，*P＜0.05;與本組同時(shí)間免疫1次者比較，#P＜0.05，與免疫2次者比較，ΔP＜0.05;與同時(shí)間LPSp實(shí)驗(yàn)組、狂犬病毒蛋白組免疫4次者比較，▽P＜0.05;與同時(shí)間狂犬病毒蛋白組免疫2次者比較，▲P＜0.05

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3 討論

研究顯示，隨狂犬病毒血清型變異及養(yǎng)犬熱日益升溫［7，8］，狂犬病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。由于疫苗接種的依從性是影響免疫接種成功與否的關(guān)鍵因素之一，開(kāi)發(fā)高效、安全、廉價(jià)、免疫程序短的新型狂犬病疫苗及新型疫苗佐劑已成為日前狂犬病疫苗研究領(lǐng)域中的重要內(nèi)容。LPSp對(duì)細(xì)胞免疫及體液免疫均有輔佐作用，可增強(qiáng)多糖抗原及蛋白抗原的免疫反應(yīng);其在體內(nèi)不易降解，對(duì)腫瘤、潰瘍、燒傷、皰疹等多種疾病有肯定療效。

本研究顯示，免疫2、4次后LPSp實(shí)驗(yàn)組抗狂犬病毒IgG抗體滴度均顯著高于狂犬病毒蛋白組和鋁佐劑疫苗組，且4次免疫后抗體滴度在第60天仍呈上升趨勢(shì)(抗體至少維持在8周以上)，而鋁佐劑疫苗組IgG抗體滴度在45 d已達(dá)高峰，其后逐漸下降;各組免疫1、2次者免疫效果均欠佳。提示4次免疫后LPSp能持續(xù)刺激高滴度抗狂犬病毒IgG抗體產(chǎn)生，且使抗體維持更長(zhǎng)時(shí)間;狂犬病蛋白疫苗免疫原性較弱。本研究還顯示，LPSp實(shí)驗(yàn)組免疫4次者各個(gè)時(shí)間點(diǎn)IgG抗體滴度均顯著高于常規(guī)組，且可維持更長(zhǎng)時(shí)間;LPSp實(shí)驗(yàn)組免疫2次者IgG抗體滴度與鋁佐劑疫苗組免疫4次者效果相當(dāng)。提示LPSp佐劑疫苗的免疫效果優(yōu)于鋁佐劑疫苗，有望減少免疫次數(shù)、提高疫苗接種依從性。

此外，本研究還顯示，LPSp實(shí)驗(yàn)組在第1次免疫后第7天IgM抗體滴度顯著高于狂犬病毒蛋白組與鋁佐劑疫苗組，第7天后IgM抗體滴度下降，但再次免疫時(shí)又出現(xiàn)以上趨勢(shì);免疫2次后LPSp實(shí)驗(yàn)組IgG抗體滴度達(dá)高峰時(shí)間顯著早于狂犬病毒蛋白組和鋁佐劑疫苗組。提示LPSp能顯著增強(qiáng)IgM抗體產(chǎn)生;LPSp可能促進(jìn)狂犬病疫苗免疫后的早期保護(hù)效果。

綜上所述，LPSp作為狂犬病毒蛋白疫苗的佐劑可顯著提高小鼠產(chǎn)生抗狂犬病毒IgG、IgM抗體的滴度，且可延長(zhǎng)抗體的維持時(shí)間、減少接種次數(shù)，其效果優(yōu)于鋁佐劑。

［1］林海祥，Perrin P.鋁佐劑對(duì)實(shí)驗(yàn)狂犬病疫苗的影響［J］.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，1999，13(2):133-135.

［2］余光開(kāi)，彭建一.狂犬病免疫程序研究［J］.中國(guó)人獸共患病雜志，1995，11(4):50-51.

［3］冷靜，葉峻，黎肇炎，等.成團(tuán)泛菌低分子脂多糖的分離純化和鑒定［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20(6):840-842.

［4］冷靜，韋錦斌.成團(tuán)泛菌低分子脂多糖的遺傳毒性研究［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，24(5):676-677.

［5］Leng J，Wang QH，Wang J，et al.The regulatory effect of LPSp on hepatitis B surface antibody［J］.Chin J Chro Dis，2004，3(4):84-88.

［6］王健，冷靜，王啟輝.LPSp輔佐HBsAg誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的機(jī)制［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007，23(6):559-561.

［7］李浩，陶曉燕，宋淼，等.狂犬病高發(fā)地區(qū)犬只感染情況調(diào)查分析［J］.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2008，22(3):161-164.

［8］梁炯明，盧耀娟，胡昱，等.玉林市10年狂犬病流行病學(xué)分析［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生管理，2009，25(2):177-178.